[发明专利]一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法

说明书

本发明公开了一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法。所述LAMP引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。本发明的LAMP引物组及其检测方法检测腐烂茎线虫的特异性、灵敏性非常好，不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，还可以从多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品中直接检测出腐烂茎线虫，检测灵敏度可达到1/1000单条虫DNA。本发明为腐烂茎线虫的快速检测鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法，其具有准确、灵敏、稳定和结果判定直观的优点，该发明操作简便、实用性强，对于口岸和调运检疫以及产地监测工作具有重要的意义和应用价值。

技术领域

本发明属于病原检测技术领域。更具体地，涉及一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法。

背景技术

腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne，1945）是一种迁移性的内寄生线虫，已知寄主120多种，主要为害甘薯和马铃薯，是农业上的重要病原线虫。在美国由于该线虫危害造成马铃薯产量的损失每年平均达10%。在中国，腐烂茎线虫病是制约甘薯生产的三大重要病害之一，近年来业已上升为北方甘薯产区最严重的病害，一般发病田块减产20%～50%，重病田块基本上绝产无收；在中国该线虫还危害当归、人参和三七等多种药材植物，危害当归严重时发病率高达84.9%。为了控制腐烂茎线虫的传播扩散导致更大的危害和损失，中国及其他国家和地区将其列为植物检疫性线虫。腐烂茎线虫种类的鉴定目前主要是利用形态学方法，主要是依据雌成虫的形态特征，通过高倍显微镜和扫描电镜观察获得形态特征信息，并与文献对腐烂茎线虫的形态描述进行比对分析，做出判定，而且卵、幼虫和雄虫均不适于形态学方法鉴定。此外，茎属线虫种类多，种间形态差异小，并且腐烂茎线虫还经常与其他类群线虫混合发生，运用形态学方法鉴定相似的茎属线虫种类或从多种混合的线虫中鉴定腐烂茎线虫非常困难，并且需要几天时间和多条线虫。因此研究和使用分子生物学方法快速准确的检测鉴定腐烂茎线虫是非常有必要的。

目前，对于腐烂茎线虫的分子生物学鉴定，Wendt和宛菲均根据腐烂茎线虫rDNA-ITS区域设计了特异性引物，利用常规PCR技术进行分子鉴定（Wendt,1993;宛菲等,2008），该方法虽然具有准确、灵敏的特性，但是依然存在一定的局限性：（1）对于多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品，已有PCR检测方法需要先从样品中分离出目标线虫，然后才能进行检测，过程繁琐、工作量大；（2）其所述检测方法需要数小时，而且检测灵敏度较低，当样品中腐烂茎线虫含量较低时，无法实现目的；（3）需要用精密而昂贵的RCR仪，检测过程复杂，结果需要琼脂糖凝胶电泳检测才可以判定，不能满足口岸和调运检疫以及田间监测的需求。另外，环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplicationof DNA, LAMP）是本世纪初开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP扩增过程依赖识别靶序列的6个独立区域，特异性强，灵敏度高，而且扩增速度快、对实验设备要求低、检测结果可以通过肉眼直观判断，因此该方法高效、快速、经济、操作简单，应用前景极为广泛。发明专利201110228196.6公开了一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，针对甘薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区设计了3组引物，可实现甘薯腐烂茎线虫的检测以及A型和B型的鉴定，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。但是，该方案仍然没有解决多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品无法直接检测的问题，还是需要分离出样本中的线虫后再进行检测。而在实际的基层检测以及大批量筛查工作中，由于实验仪器设备的限制、人员能力的限制以及工作量大等因素的限制，亟需一种可以直接以样本总DNA为模板进行检测的技术。