[发明专利]一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒及其测试方法

权利要求书

1.一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；

所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；

分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到可溶性生长刺激表达基因2蛋白的定量测定试剂盒；

(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：

用校准品缓冲溶液溶解可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；

(二)、所述抗试剂的配制：

1)抗试剂缓冲液的制备：

将10g～20g的Na₂PO₃H·12H₂O、1～2g的NaPO₃H₂·12H₂O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4M HCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；

2)异硫氰酸荧光素与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体：

首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体；

3)碱性磷酸酶与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：

首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：可溶性生长刺激表达基因2蛋白＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体；

将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂。

2.根据权利要求1所述的测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法将将160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCL调整至PH7.4，用双蒸水定容至1000ml。

3.根据权利要求1或2任一项所述的测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述步骤3)中的表面活性剂为Tween 20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。

4.根据权利要求1或2任一项所述的测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：

1)将充分混匀后的羧基磁珠浓缩液放入反应瓶中，将该反应瓶在磁场内放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；再将反应瓶置于磁场中15～20min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10～50mg/mL，混匀待用；

2)连接反应：按照质量比羧基磁珠溶液：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；

3)反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。