[发明专利]一种制备单倍体核细胞的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供一种单倍体核细胞的制备方法，包括：将次级卵母细胞中的第一极体取出并放置在次级卵母细胞的卵周间隙中除原位置外的任意位置，融合第一极体和次级卵母细胞并激活，使其分裂为第二极体和单倍体核细胞，再使第二极体与单倍体核细胞完全分离。本发明的方法提高了卵子遗传物质的利用效率，有效降低突变线粒体的残留量，且操作简便。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体提供一种制备单倍体核细胞的方法。

背景技术

线粒体基因病(Mitochondrial genic disorders)是线粒体基因组中发生基因突变所导致的一类疾病，其传递和表达完全不同于由核基因突变引起的疾病，是一组独特的遗传病。正是由于线粒体疾病本身的特点，故目前的辅助生殖技术无法从根本上解决其向子代的传递。目前针对该类疾病的潜在的有效解决手段是进行线粒体置换，也就是将疾病患者卵母细胞的细胞核转移到含有正常线粒体的卵母细胞质中，从而达到阻断突变线粒体向子代传递的目的。目前主要用于线粒体置换的母源细胞核主要有纺锤体(第一次减数分裂后的产物)。纺锤体结构的观察需要借助于特殊的观察设备，另外纺锤体结构受环境的影响非常大，因此在日常操作中经常出现无法鉴别纺锤体位置的现象。另外，由于纺锤体结构本身的体积较大，因此最终的线粒体残留量难以控制。

用于线粒体置换的其他类型的细胞核有第一极体(第一次减数分裂后的产物)、第二极体(第二次减数分裂后的产物)以及原核(第二次减数分裂后的产物)。由于第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物在染色体的状态及卵子所处发育时期具有显著的差异，因此一般情况下同一个卵子只能提供一个或两个细胞核物质用于线粒体置换操作，这一方面给操作带来了很大的不便(细胞核处于不同的状态)；另一方面不能充分利用卵子的核物质样本，这对于卵子数目极少的患者显得尤为不利。

发明内容

本发明目的在于提供一种单倍体核细胞的制备方法，以提供更多的可以用于线粒体置换的细胞，从而解决现有技术中存在的问题。

本发明的单倍体核细胞的制备方法包括如下步骤：

(1)提供次级卵母细胞，用显微操作针将第一极体取出；

初级卵母细胞在完成第一次减数分裂后形成次级卵母细胞，停滞在第二次减数分裂中期，此时卵周间隙中含有第一极体；

所述次级卵母细胞来自任何非人哺乳动物，如猴子、小鼠、兔子、牛；

(2)将取出的所述第一极体放置于所述次级卵母细胞的卵周间隙中除原位置以外的任意位置；

(3)将所述第一极体与次级卵母细胞进行融合；

(4)激活完全融合的上述细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；所述激活为人工体外激活；

(5)在激活后特定时间内，用显微操作针分别将所述两个第二极体与邻近的两个单倍体核细胞分离开来，得到四个单倍体细胞；所述单倍体核细胞包含细胞核及一小部分细胞质；所述一小部分细胞质的量为尽量少，如所述单倍体核细胞基本上不包含细胞质；

这步操作的目的即是减少单倍体核细胞中的细胞质，从而减少线粒体的量，减少发病的可能性；因此，细胞质的量应当尽量少，所述量可以实现本发明目的且本领域技术人员可以实现这样的操作；

(6)将步骤(5)中得到的四个单倍体细胞在培养液中培养1-4小时，使第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。

用显微操作针取出第一极体、将第一极体放置于卵周间隙中、将第一极体与次级卵母细胞融合、激活融合的细胞以及细胞核与细胞质分离开这些操作都是本领域常规技术。

在本发明的一个实施方案中，步骤(1)、(5)中所述的显微操作针内径可为10微米－30微米，优选内径为20微米。