[发明专利]一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体是一种大肠杆菌胞外生产N‑糖基化重组蛋白的方法。本发明方法主要步骤包括构建敲除大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp基因的大肠杆菌菌株、引入外源N‑糖基化机制到所构建的大肠杆菌中、构建质周腔中表达目的蛋白的载体及自动诱导方式表达目的蛋白，可实现利用大肠杆菌N‑糖基化修饰目的蛋白并实现N‑糖基化蛋白分泌到胞外。该方法降低了外源基因表达产物在质周腔过度积累所造成的代谢负荷，提高了N‑糖基化目的蛋白总产量；无需破碎细菌而从培养基中直接分离纯化N‑糖基化蛋白，简化了分离纯化步骤，易于大规模工业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法。

背景技术

近来应用大肠杆菌原核表达系统来生产糖蛋白日益受到重视。大肠杆菌具有基因组背景清楚、工程菌株构建简单快速、生长速度快、生产周期短、发酵成本低、产量高、适合大规模工业化生产等优点。目前，可以通过基因工程改造大肠杆菌菌株及将外源N-糖基化机制引入大肠杆菌，使其获得表达N-糖基化蛋白的能力。主要是将空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)糖基转移酶pglB及不同来源的糖基转移酶转到大肠杆菌体内，使其具有在大肠杆菌质周腔中N-糖基化修饰重组蛋白的能力，在此系统中只有在质周腔中才能实现N-糖基化修饰重组蛋白，所以重组蛋白须通过信号肽引导到质周腔中。而在质周腔中表达重组蛋白，表达量往往远远低于在大肠杆菌胞质内表达，所以导致N-糖基化的蛋白总量减少。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种应用基因敲除大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp进行胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，可以显著提高重组N-糖基化蛋白的表达量，表达的N-糖基化重组蛋白直接分泌到培养基中，无需通过离心收集及再破碎大肠杆菌的方式获得N-糖基化重组蛋白，简化N-糖基化蛋白分离纯化步骤，显著降低生产成本。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株构建；

(2)构建大肠杆菌质周腔中表达目的蛋白的载体，结合空肠弯曲杆菌N-糖基化机制，得到能胞外生产N-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌。

(3)步骤(2)中获得的能胞外生产N-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌在自动诱导培养基中诱导胞外生产N-糖基化重组蛋白。

(4)步骤(3)获得的重组蛋白纯化后即得N-糖基化重组蛋白。

进一步地，步骤(1)是利用Red同源重组方法将大肠杆菌K-12来源的W3110ΔWecA中的外膜脂蛋白Lpp基因敲除，构建大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株。

进一步地，步骤(2)所述空肠弯曲杆菌N-糖基化机制是将来源于空肠弯曲菌中编码寡糖转移酶pglB基因(Gene ID:905417)、寡糖合成基因簇以及含有编码寡糖转移酶pglB识别序列的目的蛋白基因的质粒转入大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株中。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明应用一种大肠杆菌敲除菌株W3110ΔWecAΔLpp使N-糖基化重组蛋白分泌到胞外的培养基中，可以提高重组糖蛋白表达水平和降低分离纯化成本，无需通过离心收集及再破碎大肠杆菌的方式获得N-糖基化重组蛋白，简化N-糖基化蛋白分离纯化步骤，提高N-糖基化蛋白总产量，最终有利于N-糖基化药物蛋白或糖疫苗的大规模生产。

本发明所述应用基因敲除大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，可降低目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达量；同时减少重组蛋白的胞内过度积累，而降低包涵体形成；消除细胞破壁工艺，减少致热原污染，方便分离纯化，进而降低生产成本。

附图说明

图1是rFn3-Gly基因结构图；