[发明专利]一种能特异性敲减RBM47基因的慢病毒的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种人RNA结合蛋白在临床肺癌中表达情况及该基因在肺癌中的作用，涉及分子生物学领域及肿瘤学领域。该种人RNA结合蛋白的国际命名为RBM47，基因ID号为54502，具有RBM47‑a和RBM47‑b的两种类型的亚型。基于该基因序列所研制的siRNA可能对肺癌的靶向治疗具有十分重要的应用价值。利用该慢病毒感染肺癌细胞，可以抑制肺癌细胞的增殖、克隆形成能力及细胞周期进展。本发明公开了能特异性敲减RBM47基因的shRNA序列及慢病毒的制备方法，以及该慢病毒对肺癌细胞的作用。

技术领域

本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体涉及一种能特异性敲减RBM47基因的慢病毒的构建方法及其应用。

背景技术

RNA结合蛋白基因表达的转录后调控发挥重要作用，其通过结合到特异性mRNA靶点，通过参与剪接、聚腺苷酸化、翻译等不同步骤调控RNA。RNA结合蛋白RBM47，其编码基因定位于4号染色体短臂14号位点，有同型体a、b都含有3个RNA识别基序(RNA RecognitionMotif，RRM)域(aa72-145、aa152-229及aa247-314)，提示两种同型体都具有RNA结合蛋白(RNA Binding Proteins，RBPs)活性。

新近研究表明，RBM47作为RBP通过A2M参与神经发育，在斑马鱼胚胎头颅形成与胚胎模式中起重要作用；同时也是小鼠胚胎发育、生存及生长所必需，在小鼠胚胎干细胞中表达，可与Nanog转录本结合。在RNA编辑方面，RBM47是RNA胞嘧啶-尿嘧啶编辑体的必需组成，能替代同源物A1CF参与APOBEC1对Apob mRNA的编辑。遗憾的是，目前关于RBM47蛋白表达情况以及在肺癌等疾病中的作用及机制尚未见报道。

发明内容

本发明涉及一种人RNA结合蛋白RBM47，目的在于提供一种能特异性敲减RBM47基因的shRNA序列及慢病毒的制备方法，并进一步验证该慢病毒对肺癌细胞的作用，及其可作为潜在治疗靶点的应用前景。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

1.检测RBM47蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：

(1)临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的177例Ⅰ—ⅢA期肺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性107例，女性60例；患者平均年龄57岁，年龄范围27至78岁；

(2)苏木素—伊红(HE)染色进行病理诊断；

(3)免疫组化检测RBM47蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；

(4)统计分析RBM47蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；

2.一种能特异性干扰RBM47基因的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人RBM47基因的转录本及编码(CDS)区信息；

(2)根据RNAi序列设计原则，针对人RBM47基因的编码区，设计2个能特异性敲减人RBM47基因的靶序列；

(3)根据GV248载体及(2)中设计的靶序列，选择合适的限制性内切酶(AgeI和EcoRI)，分别于靶序列的5’端和3’端加上AgeI、EcoRI限制性内切酶位点，化学合成该靶序列(单链引物)；

(4)将(3)中合成的单链引物粉末溶于退火缓冲液中，90℃水浴15min，待其自然冷却至室温，形成双链DNA；

(5)载体酶切：根据限制性内切酶说明书，配制50μl酶切反应体系，将其置于37℃酶切过夜；