[发明专利]应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法

说明书

本发明涉及一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。本发明首次将模拟流动床应用于FMD灭活病毒抗原的分离纯化，可实现连续饱和上样分离操作，大大提高了上样量；且通过多个单体柱连续分离纯化，连续化程度高，大大缩短了分离纯化时间，提高了制备效率，降低了运行成本。且本发明特定的选择刚性填料，使其填料载量即耐压性大幅提高，减少了色谱填料的使用量，延长了模拟流动床中色谱柱的使用寿命。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品制造技术领域，具体涉及一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法。

背景技术

口蹄疫病毒(FMD)是一种在偶蹄类动物间传播的具有经济破坏性的病毒疾病。口蹄疫病毒疫苗样品中与刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完整病毒颗粒，其沉降系数为146S，被认为与口蹄疫疫苗的效率具有平行关系。国际上口蹄疫疫苗生产主要采用悬浮培养技术，培养反应为3000L-8000L之间，后续纯化工艺主要采用包括聚乙二醇沉淀，超滤除杂，双水相萃取等方法。但这些方法均难以获得高纯度的口蹄疫疫苗抗原。

近年来工业色谱技术逐渐被应用于口蹄疫灭活病毒抗原的纯化，相继有专利报道采用凝胶过滤的方法来纯化口蹄疫病毒抗原(中国发明专利CN102988970B中公开的口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用)、采用离子交换层析系统来纯化口蹄疫病毒抗原(中国发明专利CN104818254A中公开的离子交换色谱纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法.)、采用疏水作用层析系统来纯化口蹄疫病毒抗原(中国发明专利CN104892734 A中公开的疏水作用层析提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法)。从专利中内容来看，目前其均采用固定床色谱的方法对口蹄疫病毒抗原进行纯化，其纯化步骤为平衡--上样--清洗--洗脱--在线清洗--平衡，然后继续进行单线循环。应用上述色谱方法纯化时往往存在上样量小、填料载量低、单线操作导致纯化工艺时间长样品损失大、废液产生量大及处理费用高等问题。

模拟流动床技术是从上世纪60年代发展起来的一门纯化技术，最初只是应用于石油化工产品的分离，90年代法国Seperex将其应用于药物及精细化工领域的分离纯化，近年年来逐渐应用于糖类、同分异构体、手性化合物、生物发酵液的分离纯化，而口蹄疫悬浮培养灭活病毒抗原的分离纯化，目前还未有将模拟流动床技术应用于病毒样品的分离纯化，主要是应用此技术对流动床体内的填料要求很高，需要寻找耐磨损、耐高压、耐酸碱处理的填料，而目前口蹄疫灭活病毒抗原纯化的普通色谱法的填料是基于葡聚糖或琼脂糖基质的填料，其粒径一般为75um、承压性小于0.3MPa，长时间的酸碱处理容易导致官能基团的脱落导致纯化效果差等问题，限制了模拟流动床技术在口蹄疫灭活病毒抗原纯化领域的应用。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：

S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；

S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。

优选地，所述S2的具体步骤为：