[发明专利]稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备与应用

说明书

本发明提供一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系，其保藏号为CGMCC No.14316。该细胞系不仅能识别非洲猪瘟的多克隆抗体，而且还能与非洲猪瘟感染猪的阳性血清发生特异性反应。本发明的非洲猪瘟P54抗原的单克隆Vero细胞系可用于稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白，可作为细胞模型或病毒感染模型进行应用，细胞传代稳定性好，生长速度快，培养条件简单，能保证大量供应，对于非洲猪瘟的检测及致病机理研究具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程及免疫技术领域，具体地说，涉及一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备方法与应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种猪的烈性、高度接触性传染病。1921年，肯尼亚首次记录了非洲猪瘟的爆发，目前非洲大陆次撒哈拉地区的大多数非洲国家均有流行。该病于1957年传入欧洲南部地区，1971年传入加勒比海地区和南美洲，2007年传入高加索地区和俄罗斯，现在仍在非洲、南撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯流行。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，在《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中，ASF被列为优先防范的13种重大外来动物疫病之一。目前我国还未发现有该病，但2007年,非洲猪瘟传播至欧亚接壤的高加索地区并很快传至格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆以及俄罗斯地区,且呈现出继续蔓延的趋势，这使得我国对该病的防控形势十分严峻。

ASFV属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，是一种有囊膜的双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。病毒基因组全长为170kb～190kb，整个基因组含有151个ORF，可以编码150-200个蛋白质，可以编码的结构蛋白有54种以上，包括p54、p72、p30等。其中p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜，是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码，分子质量约为25ku，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网处。P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网转化成病毒包膜前体时起十分重要的作用。P54蛋白可分泌到病毒体外，并以二硫键连接的I型膜结合物形式感染细胞，而且感染细胞后在内质网膜处短暂表达，对该基因的转录分析表明，P54基因的转录发生在病毒感染的晚期，是ASFV晚期病毒蛋白。在弱毒攻毒后7～10d即可检测到抗体，用P54蛋白建立的ELISA抗体检测方法，具有很高的敏感性，特异性和稳定性，与OIE全病毒抗原ELISA水平相当，是目前综合评价最好的诊断抗原，已应用于ELISA检测中。

ASF可通过与野猪接触、受污染的猪制品和媒介昆虫传播。除非洲外,该病已经在美洲、欧洲等多个国家发生，尤其2007年以来,与我国紧邻的俄罗斯联邦国家已有发病报道，且多个发病国家集中在欧亚两大洲交界处，所以该病具有传入我国极大的潜在风险。为了维持我国畜牧业健康持续发展，保护国民身体健康以及维护国家利益，开展该病的检测技术研究具有重大意义。

目前，针对该疫病的检测主要有以下几种主要的方法：1)基于主要抗原-抗体的ELISA方法，包括基于P72和P54的ELISA试剂盒，这些试剂盒成本昂贵，且有国外公司设置了专利保护壁垒，国内没有成熟的商品化试剂盒；2)基于病原核酸的检测方法，包括PCR、荧光PCR等，但这些方法存在容易交叉污染的弊端，且需要其它方法辅助进行进一步鉴别；3)基于病毒学的IFA研究方法，该方法是OIE推荐的实验室确诊方法。但该方法有病毒感染过程，操作繁琐耗时长，且涉及生物安全的问题，因此应用范围受限，亟需该方法的替代方法。本发明利用非洲猪瘟的敏感细胞Vero细胞首次建立了非洲猪瘟主要抗原P54的稳定单克隆vero细胞系，可用于非洲猪瘟病毒感染的检测和确诊，而且无需活病毒感染，在普通条件下即可对样品进行确诊，有效缩短了检测时间。建立的稳定单克隆Vero细胞系还能进一步用于非洲猪瘟病毒的致病机理的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的细胞系及其制备方法与应用。