[发明专利]五羟色胺-磁性微粒复合物及富集唾液酸化糖蛋白的方法

说明书

本发明提供一种五羟色胺‑磁性微粒复合物及富集唾液酸化糖蛋白的方法，复合物为表面固定有五羟色胺的磁性微粒。本发明利用环氧化修饰的磁性微粒作为固定五羟色胺的载体，在偏碱性条件下，通过氨基与环氧基的开环反应，将五羟色胺共价偶联于环氧磁粒表面。通过磁性微粒对磁场的定向响应及五羟色胺对唾液酸的特异性识别，建立了操作简便、稳定性良好的唾液酸糖蛋白富集方法。对复杂蛋白质样品进行了唾液酸糖蛋白的富集，显示出较好的结果。

技术领域

本发明涉及唾液酸化糖蛋白检测，具体涉及一种五羟色胺-磁性微粒复合物及利用该复合物富集唾液酸化糖蛋白的方法。

背景技术

唾液酸是一类带羧基的九碳单糖化合物及其衍生物的通称，蛋白质唾液酸化修饰是重要的蛋白质翻译后修饰之一，对于蛋白质的结构和功能具有非常重要的影响，在生物体内发挥着重要的生物学作用，如病毒与细胞间的识别、信号的传导，免疫应答以及细胞间的相互作用，此外，生物体内异常的唾液酸化与许多肿瘤的发生发展有密切的关系。由于唾液酸糖蛋白在复杂样品中丰度低和微观结构的不均一性，尤其酶解后唾液酸糖肽的含量更低，因此对于唾液酸糖蛋白的研究，首先要解决唾液酸糖蛋白/糖肽的富集问题。目前，针对唾液酸糖蛋白/糖肽的富集方法主要有利用特异凝集素富集、亲水色谱、强阳离子交换色谱、二氧化钛色谱、木质纤维色谱，以及利用五羟色胺(简称5-HT)为配体进行富集。但这些方法均有各自的缺点，比如利用凝集素富集的方法特异性低、成本高，而亲水色谱、强阳离子交换色谱、二氧化钛色谱、木质纤维色谱受到磷酸化蛋白的影响，富集过程耗时长，反应条件苛刻。目前利用五羟色胺为配体对唾液酸糖蛋白/糖肽进行富集，主要存在的问题在于配体识别并结合后难于快速分离得到结合的唾液酸糖蛋白/糖肽。

磁性微粒作为一种具有超顺磁性且可以被功能基团修饰的载体，被广泛应用到生物化学、细胞生物学、微生物学，以及临床医学等众多领域。磁性微粒被广泛应用的原因是其具有以下特征：磁响应性好、矫顽力基本为零，即具备超顺磁性；粒径可以达到纳米级；具有很好的化学稳定性；生产工艺相对简单，且价格合理。

目前，尚未见制备偶联有五羟色胺的磁性微粒到报道。主要的研究难点在于磁性微粒表面用于偶联五羟色胺的修饰结构的设计，从而充分发挥五羟色胺识别和结合唾液酸糖蛋白/糖肽的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种五羟色胺-磁性微粒复合物及富集唾液酸化糖蛋白的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种五羟色胺-磁性微粒复合物，该复合物为表面固定有五羟色胺的磁性微粒。

所述复合物包括结合于Fe₃O₄磁性微粒表面的硅原子以及与所述硅原子连接的功能化基团，所述功能化基团的结构如式1所示：

式1中，n的取值为3～5，R为即R为五羟色胺的氨基脱去一个氢原子后剩余的部分。

优选的，所述n的取值为3。

所述Fe₃O₄磁性微粒采用化学共沉淀法制成。

上述五羟色胺-磁性微粒复合物的制备方法，包括以下步骤：

利用环氧化修饰的磁性微粒作为固定五羟色胺的载体，在碱性条件下，将五羟色胺通过氨基与环氧基的开环反应共价偶联于所述载体表面。

所述制备方法具体包括以下步骤：

1)向分散均匀的0.4～1.2g Fe₃O₄磁性微粒中加入3～7mL环氧化试剂和0.2～0.6mL冰乙酸，然后于20～30℃水浴中反应2～4h，反应结束后用无水乙醇清洗，然后于60～80℃下烘干，得到环氧化修饰的磁性微粒；