[发明专利]一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒，包括检测罗湖病毒病原的恒温荧光检测引物组，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，外引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，内引物的序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，环引物的序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。本发明的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，对于含有罗非鱼罗湖病毒病原检测靶标基因的阳性质粒，最低检出限可达到1fg/μL，检测时间短，可在45分钟左右获得检测结果，最快10分钟即可得到阳性结果，比常规PCR节约3~4小时。试剂盒采用一步法反应，防污染能力强，杜绝气溶胶污染。操作便捷，易于推广。试剂盒对人和环境较安全，原料成分及产物中不含有毒物质。

技术领域

本发明属于对鱼类病毒检测领域，特别涉及一种用于罗非鱼湖病毒的监测及诊断技术。

背景技术

2017年5月26日，粮农组织全球信息及预警系统发布特别警报：一种传染性很强的疾病正在养殖和野生罗非鱼中传播。现已查明导致该疾病的病原物名为“罗湖”病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV）。罗湖病毒（TiLV）是一种传染性很强的病毒,可导致受感染鱼群大量死亡，死亡率高达80%~90%。2009年罗湖病毒在以色列和厄瓜多尔首次被报道，后来在三大洲的5个国家都发现疫情，包括哥伦比亚、厄瓜多尔、埃及、以色列和泰国。2015年以来，该病毒在泰国大范围爆发，属于亚洲首例。罗非鱼是世界第二大水产养殖品种，中国是罗非鱼的第一大养殖国，产量约占世界总产量的40%，其中海南省是罗非鱼的最大养殖省份，占全国罗非鱼总产量的42%。2017年6月13日，中国 台湾地区确认首例“罗湖”病毒疫情，罗非鱼出现大量死亡情形。从目前情况来看，“罗湖”病毒疫情来势猛、传播快、损失大，防控形势较为严峻，传入我国的风险明显增大。一旦爆发输入性“罗湖”病毒疫情，将会重创我国罗非鱼养殖业。

感染罗湖病毒的患病罗非鱼主要临床症状表现为食欲不振，游动缓慢，皮肤损伤和溃疡；组织学病变主要发生在脑、眼和肝脏，表现为脑水肿，脑膜出血；眼部病变明显，初期晶状体浑浊，后期晶状体破裂；肝脏、肾脏出血，脾脏肿大等，并可以由已经被感染的罗非鱼向未被感染的罗非鱼传播。研究表明，该病毒是一种类似于正黏病毒的新型病毒。TiLV基因组由10个节段的负链RNA组成。节段1最大为1.641kb，节段2-10分别为1.471kb、1.371kb、1.250kb、1.099kb、1.044kb、0.777kb、0.657kb、0.548kb、0.465kb。其中，节段1包含一个开放阅读框，与流感病毒C的PB1亚基具有低相似性，其他9个节段与其他病毒无相似性。但9个节段的5’和3’端序列之间具有保守互补序列，这与正黏病毒科的病毒是相似的。在发病鱼的肝脏和大脑中能检测到病毒的核酸，此外细胞培养液中繁殖的病毒能够引起无病罗非鱼患病。目前已有文献报告该病毒还可以侵染草鱼，黄头鱼，斑点叉尾鮰和花身副丽鱼等其他鱼类品种。

国内外已有的报道对罗非鱼罗湖病毒分子的检测一般采用巢式PCR，半巢式PCR和定量PCR的方法。目前在国内关于罗湖病毒检测方法的研究不多，市面上更少有检测试剂盒。如果将国外文献中的常规检测方法应用于养殖病害监测和出入境检疫中，其检测时间长且工作量大、主观性强，不利于湖病毒的检测与预防。同时，无法在边境检疫方面避免带病毒样品进入我国，无法将潜在发病信息传递给有关工作人员，及早通知养殖户及早采取防御措施限制该病毒病的大范围爆发。因此，急需建立快速灵敏的TiLV检测技术。