[发明专利]固定化酶、其制备方法及其在修复莠去津污染土壤中的应用

权利要求书

1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将HB-5菌种破碎离心分离得到酶液；

将所述酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，随后滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；

将所述微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中；所述壳聚糖的醋酸水溶液中壳聚糖的质量分数为3％或4％，所述酶液和所述壳聚糖的质量比为1：30～40，所述氢氧化钠溶液的质量分数为5％或者8％；所述氢氧化钠溶液中含有质量分数1％～2％的烷基磺酸盐。

2.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述HB-5菌种按2％～4％的接种量使用液体培养基在28～35℃下培养48h以上，随后进行所述破碎离心分离作业，所述液体培养基包含蔗糖3～5g/L，酵母浸膏1～3g/L，K₂HPO₄1.6～2.5g/L，KH₂PO₄0.4～0.6g/L，MgSO₄·7H₂O0.2～0.5g/L，NaCl0.1～0.4g/L，微量元素溶液2～4mL/L，莠去津100～300mg/L。

3.根据权利要求2所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述微量元素溶液包含EDTA2～2.5g/L，FeSO₄·7H₂O1～2g/L，ZnSO₄·7H₂O3～5g/L，MnSO₄·H₂O1～2g/L，CuSO₄·5H₂O0.4～0.8g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O0.2～0.5g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.25～0.5g/L。

4.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述破碎离心分离是将所述HB-5菌种在4℃下于8000～9000rpm离心8～12min后收集菌体，并用0.05～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤1～3次后于8000～9000rpm二次离心8～12min收集菌体，随后将收集的菌体和磷酸盐缓冲液按1g：2～3mL的比例混合后冰水浴超声波破碎10～20min后在4℃下于9000～10000rpm离心15～20min收集上清液，超声功率为280～350W。

5.根据权利要求4所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎时，每破碎5～20s，间隔5～20s。

6.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述微球和质量浓度3％～5％的海藻酸钠溶液按1：25～40的质量比混合后滴入质量分数4％～8％的氯化钙溶液中。

7.一种固定化酶，其特征在于，其是采用如权利要求1-6中任一项所述的固定化酶的制备方法制备得到。

8.如权利要求7所述的固定化酶在修复莠去津污染土壤中的应用；将土壤分为灭菌处理组和不灭菌处理两组，其中，灭菌处理组包括对照组、添加酶液组和添加固定化酶组，灭菌组在121℃下连续灭菌2h，不灭菌处理组包括对照组的处理、添加酶液组和添加固定化酶组，每个处理设3个重复；将土样中的莠去津浓度调整为10mg/kg后分别装于125mL的棕色瓶中，每瓶装入土壤50g；添加酶液组按照20mL/kg的量添加酶液；添加固定化酶组按照200g/kg的量添加固定化酶；随后在室温下避光培养，并于培养开始后的第0h、24h、48h、72h、96h、120h和144h从土壤中取样并分析莠去津的残留量，计算降解率，得到固定化酶对两种污染土壤中莠去津降解规律的影响。