[发明专利]一种检测谷胱甘肽探针试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针的谷胱甘肽GSH试剂盒及其检测方法。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为G-SH），易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。

色谱法：气相色谱―质谱法测定谷胱甘肽。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化。而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。

免疫学法：该法应用特异性的抗S-腺苷谷胱甘肽单克隆技术，采用荧光偏振法或免疫法测定。谷胱甘肽在S腺苷谷胱甘肽水解酶和过量腺苷存在下，被转换成S腺苷谷胱甘肽;预稀释的混合物、抗-S-腺苷谷胱甘肽单克隆抗体及标记的荧光S腺苷谷胱甘肽示踪物一同孵育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本总谷胱甘肽水平。抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测同型半胱胺酸，需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐。

循环酶法；是利用酶底物特性，放大靶物质（被测物）的检测方法。血浆氧化型谷胱甘肽经三乙羧乙基膦(TCEP)还原成游离型谷胱甘肽，基于谷胱甘肽甲基转移酶，S腺苷谷胱甘肽水解酶构成的循环酶体系以及脱氢酶辅酶体系的原理，分解产物显色，用自动生化分析仪在600nm波长测OD值得出血浆中的谷胱甘肽的含量。

目前没有能够直接识别谷胱甘肽的抗体和其它分子探针。因此设计一种高度设别谷胱甘肽的分子探针，并基于此建立简单快速和廉价的检测方法将提高对心脑血管等于谷胱甘肽相关的疾病的的监控。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分，是指能够高特异性和高亲和力地域靶分子结的单链核苷酸分子。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX）筛选获得。SELEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成) 文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~ 60 个核苷酸。核酸适体主要通过发生适应性折叠，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力与靶分子相互作用，与插入或包被的靶分子形成稳定的三维空间结构。核酸适体不与靶分子结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5' 和3' 两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5' 端和3' 端都将参与与靶分子特定区域（类似于与抗体结合的抗原位点）的相互作用，导致5' 和3' 两端相互靠近。这一特点使核酸适体适于分子信标探针设计。其中一种分子信标设计利用了荧光染料芘分子。当一个激发态芘分子和另一个基态芘分子近距离遭遇的时候能形成激发态二聚体，能在比芘单体波长更长的位置释放一个光子。芘激发态二聚体发射峰在 480 到 500nm，而芘单体的发射峰在 370 到 400nm 之间。另外，芘分子荧光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后，再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度。识别谷胱甘肽的核酸适体可以应用于谷胱甘肽的临床检测，提高检测效率，降低检测成本。

核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性, 使其在疾病诊断中具有良好的应用前景, 尽管目前成熟的临床应用报道较少, 但应用适体检测靶蛋白的研究却不断增多, 基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针对于谷胱甘肽GSH诊断试剂还很缺乏，且针对于谷胱甘肽GSH的核酸适体荧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。

发明内容