[发明专利]一种樱桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种樱桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法。

背景技术

干旱和盐碱等非生物胁迫是影响植物生长发育的主要限制因素。为适应这些非生物胁迫，植物在分子水平上进化形成了相应的机制，诱导胁迫相关转录因子的表达。因为转录因子能通过参与不同的复杂的信号通路，调控植物的生理生化活动来抵御逆境。

WRKY是目前研究较为广泛的一类植物特有转录因子，存在1个或2个高度保守的WRKYGQK结构域，紧随其后的一段锌指结构。WRKY家族成员被证实能响应植物对干旱和盐的胁迫。研究表明拟南芥和水稻中分别有74和126个家族成员，而在绿藻中仅有一个成员。Zhou等把大豆GmWRKY13和GmWRKY54分别转到拟南芥中，过量表达GmWRKY54的植株对干旱和盐害都具有一定的忍耐性，而过量表达GmWRKY13的植株对盐害和甘露醇胁迫敏感。过表达AtWRKY25和AtWRKY33能够通过影响SOS(salt overly sensitive)通路来提高拟南芥对高盐环境的耐受性。Song等用PEG，NaCl和ABA处理转OsWRKY08基因的拟南芥，发现OsWRKY08基因表达量增加，改善了转基因拟南芥渗透调节能力。相似的ZmWRKY33受高盐、干旱、低温和ABA诱导表达，且转基因拟南芥的耐盐性提高。Sun等研究表明二穗短柄草BdWRKY36能提高转基因烟草耐受干旱的能力。棉花的GhWRKY17在受干旱、高盐处理的诱导后大量表达。

WRKY转录因子广泛参与植物的生长、发育、衰老等进程，对各种生物胁迫和非生物胁迫都有一定响应。但是关于WRKY转录因子的研究多集中于拟南芥和烟草等模式植物中，而樱桃转录因子的相关研究还未见报道。

由于甜樱桃性喜温、不耐寒、不耐盐碱，所以其分布和栽培区域受到限制，因此种植樱桃除选择抗逆性强的品种，还要选择合适的具有抗性的砧木。樱桃砧木在樱桃生产中起着非常重要的作用，因此改善砧木抗逆性迫在眉睫。通过常规育种获得新品种周期较长，而通过基因工程获得抗逆新品种日益受到重视，其中关键基因的挖掘是前提。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种樱桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法，以达到樱桃的分子育种提供基因资源的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种樱桃砧木PcWRKY71基因，为从樱桃砧木中克隆得到的WRKY基因，命名为PcWRKY71，其cDNA全长1014bp，cDNA序列为SEQ ID NO.1；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列中含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂的锌指基序，属于WRKY基因家族第Ⅱ类成员。

上述方案中，所述PcWRKY71基因分子量为37.41kDa，等电点为6.72，不稳定系数为57.13，属于不稳定蛋白。

一种樱桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，包括如下步骤：

(1)RNA的提取：采用Trizol一步法提取吉塞拉6(‘Gisela 6’)樱桃苗叶片总RNA；

(2)cDNA的合成：以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR反转录，得到cDNA第一链；

(3)PcWRKY71基因的克隆：设计一对引物PcWRKY71-F和PcWRKY71-R，序列分别见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以反转录cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得PcWRKY71全长cDNA序列。

上述方案中，所述步骤(1)中，RNA的提取具体方法如下：称取吉塞拉6樱桃苗叶片0.2g，于液氮中研磨成粉末，向研钵中加入2m L TRizol充分匀浆，室温放置10min；匀浆吸入1.5mL的离心管中，加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置10min；4℃离心，12000r/min，15min，取上层液相移入另一管；加入500μL等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；4℃离心，12000r/min，15min，用枪小心吸去所有上清；1mL 75％乙醇洗两遍，离心4℃，8000r/min，10min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min；加入适量DEPC处理水，65℃促溶10-15min，保存在-80℃备用。