[发明专利]一种樱桃砧木PcWRKY71基因及其克隆方法

权利要求书

1.一种樱桃砧木PcWRKY71基因，其特征在于，为从樱桃砧木中克隆得到的WRKY基因，命名为PcWRKY71，其cDNA全长1 014bp，cDNA序列为SEQ ID NO.1；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列中含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂的锌指基序，属于WRKY基因家族第Ⅱ类成员。

2.根据权利要求1所述的一种樱桃砧木PcWRKY71基因，其特征在于，所述PcWRKY71基因分子量为37.41kDa，等电点为6.72，不稳定系数为57.13，属于不稳定蛋白。

3.一种如权利要求1所述的樱桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)RNA的提取：采用Trizol一步法提取吉塞拉6樱桃苗叶片总RNA；

(2)cDNA的合成：以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR反转录，得到cDNA第一链；

(3)PcWRKY71基因的克隆：设计一对引物PcWRKY71-F和PcWRKY71-R，序列分别见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以反转录cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得PcWRKY71全长cDNA序列。

4.根据权利要求3所述的一种樱桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤(1)中，RNA的提取具体方法如下：称取吉塞拉6樱桃苗叶片0.2g，于液氮中研磨成粉末，向研钵中加入2m L TRizol充分匀浆，室温放置10min；匀浆吸入1.5mL的离心管中，加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置10min；4℃离心，12000r/min，15min，取上层液相移入另一管；加入500μL等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；4℃离心，12000r/min，15min，用枪小心吸去所有上清；1mL 75％乙醇洗两遍，离心4℃，8000r/min，10min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min；加入适量DEPC处理水，65℃促溶10-15min，保存在-80℃备用。

5.根据权利要求3所述的一种樱桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反转录反应体系中含有总RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10μL，随机引物2pmol，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH2O至20μL，混匀；42℃孵育30min，冰上冷却2min，-20℃保存备用。

6.根据权利要求3所述的一种樱桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR扩增体系为50μL，在0.2mlPCR管中分别加入以下成分：PcWRKY71-F(10μM)1μL，PcWRKY71-R(10μM)1μL，5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，模板2μL，加ddH2O至50μL，混匀。

7.根据权利要求3所述的一种樱桃砧木PcWRKY71基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。