[发明专利]一种荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料的定量检测领域，具体涉及一种荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法，能够超灵敏荧光免疫定量检测聚琥珀酰亚胺(PSI)，N-(3-氨基丙基)咪唑(NAPI)和油胺(OAm)共同作用得到的PSI-OAm-NAPI(MFAP)纳米药物载体。

背景技术

纳米级抗癌药物已经成为一类有前途的新的癌症治疗剂，该制剂的构成除了抗癌药物本身外还有对药物递送起着决定作用的药物“运输器”。这里所说的“运输器”是指可用于载药的纳米材料，即纳米药物载体。纳米载体由包括聚合物、脂质体、囊泡、多肽的有机材料以及诸如金纳米颗粒和量子点的无机材料组成。其中，有机材料中的聚合物胶束，脂质纳米胶囊，脂质体或脂质微球得到更为广泛的关注。

传统化学材料合成的药物，由于其亲水性差且具有较大的分子量从而导致药物的吸收率低。而纳米载药系统之所以能够引起诸多关注，主要在于其在输送药物中所表现出的独特性能，如尺寸小，比表面积大，更有利于药物的输送。麻省理工学院利用纳米技术研制出只攻击癌细胞本身，不会影响到健康组织的抗癌药“纳米细胞”。这项研究的负责人、麻省理工学院生物工程学教授拉姆·萨西斯克哈仁说：“化疗的最大挑战是它对健康细胞的毒性以及癌细胞的抗药性，而‘纳米细胞’可以克服这两个问题。”这种‘纳米细胞’的直径只有200nm，但其内部却含有两种抗癌药。它的外层载有能杀死肿瘤血管的“抗血管生长”药物，内层则有能杀死癌细胞的化疗药物。

聚合物乳剂递送系统已广泛用于包封药物。许多聚合物纳米药物递送系统在临床应用中得到批准，或正在用于治疗癌症的临床试验研究中。日本化药公司利用高分子聚合物纳米材料包裹抗癌药，开发出了直径约为50nm内部含有抗癌药的纳米粒子。研究发现，将纳米粒子注入静脉后，因为正常组织周围的血管没有缝隙，而癌组织周围的血管有100nm左右的缝隙，所以纳米粒子会从这些缝隙中渗透出来攻击癌细胞，但不会损害正常细胞。由于抗癌药能够有效地抵达癌细胞，所以有望提高肿瘤治疗效果，并减少副作用。

纳米药物载体是纳米生物技术领域的前沿和热点问题，药物被“纳米化”后，其理化性质，纳米药物的药代动力学特征均可能发生改变；然而对于药物纳米制剂的生物安全性评价标准和评价方法，目前来说国际上还没有一个统一、完善的实施办法。纳米粒子的体外评价由于快速简单，故多为研究者首选，而对于纳米药物载体真实进入体内的有关研究如真实分布情况，生物相容性，机体代谢情况等甚少。其中载体在体内的代谢情况与生物体的健康密不可分，过量的药物剂量可能会引起载体代谢缓慢从而对生物体产生毒副作用。因此，药物载体的定量测定对于考察该材料是否适于临床应用尤为重要。

免疫分析法是一种利用抗原和抗体特异性结合发生免疫反应的分析方法，其在疾病防治、临床检测、生化分析等方面都有着十分广泛的应用。其中，荧光免疫技术，不仅充分利用了免疫分析的特异性，还与荧光的敏感性相结合，使检测的灵敏度进一步提高。荧光共振能量转移技术比常规荧光技术具有更强的抗干扰能力，能够避免散射光的影响，光学效率大大提高，从而实现超灵敏测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法，以介孔二氧化硅纳米颗粒为基体，以荧光染料氟硼吡咯(BODIPY)和罗丹明B共掺杂，采用过碘酸钠法偶联抗体提高了偶联效率，消除了交联剂对抗体活性的影响。充分利用了免疫学反应中抗原抗体的高特异性，并且与荧光的敏感性相结合，使免疫反应的信号进一步提高，实现了对纳米药物载体的超灵敏检测。

本发明提供的一种荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法，包括以下步骤：

a、MFAP全抗原的制备；

b、抗MFAP高特异性多克隆抗体的制备；

c、二氧化硅荧光纳米标记探针的制备；

d、二氧化硅荧光纳米标记探针采用过碘酸钠法偶联抗体；

e、荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法建立；以MFAP标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，构建浓度与荧光强度线性关系，从而定量检测出MFAP的浓度。

步骤a所述MFAP全抗原的制备，包括以下步骤：

a-1、聚琥珀酰亚胺PSI，N-(3-氨基丙基)咪唑NAPI和油胺OAm共同反应，得到PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米药物载体MFAP；

a-2、取制备的MFAP纳米粒子和聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物mPEG-PLGA，共同溶解到三氯甲烷溶液中；