[发明专利]一种荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法

权利要求书

1.一种荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、MFAP全抗原的制备；

b、抗MFAP高特异性多克隆抗体的制备；

c、二氧化硅荧光纳米标记探针的制备；

d、二氧化硅荧光纳米标记探针采用过碘酸钠法偶联抗体；

e、荧光免疫定量检测MFAP纳米药物载体的方法建立；以MFAP标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，构建浓度与荧光强度线性关系，从而定量检测出MFAP的浓度；

步骤c包括以下步骤：

c-1、将十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶于去离子水；

c-2、加入乙二醇和浓氨水，反应；

c-3、之后加入正硅酸乙酯TEOS反应；

c-4、然后，再加入混合好的BODIPY溶液和罗丹明B溶液，再加入三甲氧基甲基硅烷MTMS，反应；

c-5、最后，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES继续反应，完成反应后，搅拌冷却至室温并离心洗涤，冷冻干燥，得二氧化硅荧光纳米标记探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从步骤c-1开始，全程均在60-70℃条件下反应。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c-3中加入乙二醇和浓氨水后的3-6min内加入正硅酸乙酯。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c-4)所述反应时间为2-4h；步骤c-5所述反应时间为1-2h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d包括以下步骤:

d-1、抗体的氧化：取步骤b制备的抗MFAP高特异性多克隆抗体溶解到醋酸缓冲液中，再加入过碘酸钠溶液，于4℃避光搅拌，超滤除去未反应的过碘酸钠，得到氧化抗体；

d-2、荧光纳米粒子与抗体的偶联：将步骤c制备的二氧化硅荧光纳米标记探针分散到缓冲溶液中，在搅拌下加入步骤d-1制备的氧化抗体，于4℃下避光搅拌，之后加入硼氢化钠溶液继续4℃避光搅拌，将反应后的溶液离心，洗涤分散到缓冲溶液中，4℃储存备用。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤d-1中，所述搅拌时间为2-4h。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤d-2中第一步搅拌时间为12-36h，第二步搅拌时间为2-4h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e包括以下步骤：

e-1、包被：用碳酸盐缓冲液稀释将包被抗原溶液稀释，包被96孔酶标板，4℃温育过夜后，用PBST洗涤液洗涤，甩干；

e-2、封闭：每孔加入封闭液，恒温培养箱温育后，用PBST洗涤液洗涤，甩干；

e-3、加样竞争：每孔加入不同浓度的MFAP标准液和与二氧化硅荧光纳米标记探针偶联的抗体，温育后，用PBST洗涤，甩干；

e-4、在酶标仪上测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为590nm时的荧光强度，以MFAP标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，构建浓度与荧光强度线性关系，从而定量检测出MFAP的浓度。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤e-2所述温育是指37℃恒温培养箱温育0.5-2h；步骤e-3所述温育是指37℃温育1.5-3.5h。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤e-4中所述线性关系为：标准曲线的线性方程为A＝34877.2-13538.7lgC，A为荧光强度，C为MFAP的浓度；相关系数R＝-0.997，线性范围为0.036-10⁴ng/mL，检出限为1.4pg/mL。