[发明专利]一种基于荧光共振能量转移的二氧化硅荧光免疫标记探针、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分析和免疫分析领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的二氧化硅荧光免疫标记探针、制备方法及应用。

背景技术

聚琥珀酰亚胺(PSI)，N-(3-氨基丙基)咪唑(NAPI)和油胺(OAm)共同反应，得到的PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米颗粒(MFAP)是一种聚合物纳米药物载体。聚合物乳剂递送系统已广泛用于包封药物，许多聚合物纳米药物递送系统在临床应用中得到批准，或正在用于治疗癌症的临床试验研究中。进入生物体后的代谢情况与生物体的健康密不可分，过量的药物剂量可能会引起载体代谢缓慢从而对生物体产生毒副作用。因此，药物载体的定量测定对于考察该材料是否适于临床应用尤为重要。

荧光免疫技术不仅充分利用了免疫分析的特异性还与荧光的敏感性相结合，在疾病防治、临床检测、药物筛选、食品安全等方面都有着十分广泛的应用。其中抗体的特异性和活性对免疫分析的准确性起决定作用；标记物的荧光强度和稳定性则是灵敏度高，重现性好的关键因素。因此，荧光标记技术及标记物的筛选对高灵敏的荧光免疫分析方法建立起到举足轻重的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光共振能量转移的二氧化硅荧光免疫标记探针及其制备方法，为建立特异性好、重现性好、高灵敏的免疫分析程序提供了新的标记探针；该法以介孔二氧化硅纳米颗粒为基体，掺杂荧光染料罗丹明B和BODIPY构建荧光共振能量转移体系(RB-BODIPY-FRET)。

本发明的另一目的在于提供一种基于荧光共振能量转移的二氧化硅荧光免疫标记探针的应用，采用新的标记方法偶联抗体进一步提高了偶联效率并保证了抗体活性，消除交联剂对抗体活性的影响；为纳米药物载体的超灵敏检测免疫分析提供了可靠依据。

本发明提供的一种基于荧光共振能量转移的二氧化硅荧光免疫标记探针的制备方法，包括以下步骤：

1)、将十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶于去离子水；

2)、加入乙二醇和氨水；

3)、之后加入正硅酸乙酯TEOS反应；

4)、然后，再加入混合好的BODIPY溶液和罗丹明B溶液，再加入三甲氧基甲基硅烷MTMS，反应；

5)、再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES继续反应；离心洗涤，冷冻干燥，得RB-BODIPY-FRET二氧化硅纳米粒子，即为基于荧光共振能量转移的二氧化硅荧光免疫标记探针。

上述制备过程中全程回流冷凝。从步骤1)开始，全程均在60-70℃条件下反应。

步骤1)中十六烷基三甲基溴化铵CTAB在60-70℃搅拌条件下溶于去离子水中。

步骤3)中加入乙二醇和氨水后3-6min内加入正硅酸乙酯TEOS；反应时间为30-60min。

步骤4)所述反应时间为2-4h。

所述BODIPY溶液制备方法为称取摩尔质量为0.001-0.006mmol的BODIPY溶于1mLDMF，所述罗丹明B溶液制备方法为0.001-0.006mmol的罗丹明B溶于1mL去离子水；混合好的BODIPY溶液和罗丹明B溶液事先混合好保证反应过程中介孔二氧化硅吸附两种染料到介孔中的能力相同，避免一种染料先加入占据大多数介孔。

进一步的，步骤4)中BODIPY和罗丹明B摩尔比为1:1，并控制混合前BODIPY溶液和罗丹明B溶液浓度相同，分别为0.001mmol/mL，0.002mmol/mL，0.003mmol/mL，0.004mmol/mL，0.005mmol/mL，0.006mmol/mL；一系列加入量考察择优选择。优选的，为0.004mmol/mL，0.005mmol/mL的浓度，所制备的荧光纳米标记探针荧光强度高，稳定性好。

步骤4)混合前BODIPY溶液浓度为0.001mmol/mL-0.006mmol/mL；混合前罗丹明B溶液浓度为0.001mmol/mL-0.006mmol/mL。

所述BODIPY制备方法为：

A、20-25℃下在含有40-60mL水的圆底烧瓶中边搅拌边加入1-3mL吡咯，1-3mL均三苯甲醛，充分搅拌均匀；

B、加入0.2-1mL浓HCl，并于20-25℃反应12-24h，有大量黑色沉淀生成，抽滤后用石油醚洗涤，得到粗产品粉末1；

C、取200-600mg粗产品粉末1溶于40-60mL无水四氢呋喃中，在磁力搅拌下加入N-氯代丁二酰亚胺NCS 300-700mg，20-25℃反应1-3h。