[发明专利]一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法

权利要求书

1.一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备胶体金：采用Frens法制备胶体金溶液；

S2、胶体金标记单克隆抗体：取步骤S1制备好的胶体金溶液，加入K₂CO₃，一边搅拌一边加入，10-20min后加入罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体，搅拌10-20min，加入新配制的10％BSA，继续搅拌10-20min后进行离心，离心结束后取出离心管，小心吸弃上清液，补充加入含BSA的PB缓冲液，洗涤，再离心一次，弃去上清液后，加入重悬液，即可得到胶体金标记好的单克隆抗体液，即为金标液，将金标液置于2-5℃保存，备用；

S3、无乳链球菌的包被

无乳链球菌点样处理：将灭活的无乳链球菌点加在硝酸纤维素膜上作为检测点，再将羊抗鼠IgG也点加在硝酸纤维素膜上作为对照点，完成点样，室温干燥后，用PBST洗涤液洗涤2-3次，干燥后加入5％BSA至硝酸纤维素膜被渗透，封闭10-20min，然后用PBST洗涤液洗涤2-3次，凉干，得到硝酸纤维素样品膜，放2-5℃保存，备用；

S4、罗非鱼无乳链球菌抗体的检测及结果判断

A检测过程：检测时，使用步骤S3点样处理后的硝酸纤维素样品膜进行检测，在硝酸纤维素样品膜加入待检罗非鱼血清，罗非鱼血清渗滤后，加入PBST洗涤液，PBST洗涤液渗滤过后，加入步骤S2制得的金标液，金标液渗滤完后再加入PBST洗涤液，检测完成；

B结果判断：检测完成后同时观察硝酸纤维素样品膜的变化，在5min内，若硝酸纤维素样品膜上出现两个斑点，即对照斑点和检测斑点，则是阳性；若硝酸纤维素样品膜只出现对照斑点，则是阴性；若硝酸纤维素样品膜不出现对照斑点，则结果判为无效。

2.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S1中，所述制备胶体金溶液是在每100mL质量浓度为0.01％的胶体溶液，加入质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液1mL，制备的金颗粒大小为40nm。

3.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S2中，所述罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体是由抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体细胞株2C10分泌而得；所述抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体细胞株2C10，保藏号为CCTCC NO:C201644。

4.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S2中，所述离心的具体参数如下：转速为12000rpm，温度为4℃，离心时间为1h。

5.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S2中，所述重悬液的加入量按每1mL胶体金溶液加入100μL重悬液。

6.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S2中，各组分的加入量如下：胶体金溶液10mL；所述K₂CO₃为0.02M的K₂CO₃90μL；罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体180μg；新配制的10％BSA1mL。

7.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S2中，弃去上清液后，补充加入含BSA的PB缓冲液是由1g的BSA和100mL的PB缓冲液组成。

8.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S2中，所述重悬液为：在0.05M pH＝8.0的硼酸盐缓冲液中含如下质量百分含量的组分：10％的蔗糖，3％的BSA和0.02％的叠氮钠。

9.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S3中，所述灭活的无乳链球菌的菌液浓度为1.5×10⁹-1.5×10⁴CFU，点加在硝酸纤维素膜上的菌液加样量为2μL。

10.如权利要求9所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S4的A中，所述罗非鱼血清的加入量为2μL。