[发明专利]一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明解决了游离基因在微生物发酵中不稳定、易丢失、不利于大规模的发酵生产，生产桧烯的原料成本高问题，本发明通过CRISPR‑Cas9系统对酿酒酵母基因组进行编辑，将含有Cas9基因的pML104质粒转入酵母，在酵母中表达Cas9蛋白，同时转入含有同源臂的供体DNA，将桧烯合成酶基因SabS1整合到GAL80位点，同时将GAL80基因敲除，而不引入其它标记基因，利用5‑FOA筛选质粒丢失的转化子酵母菌株，最终获得合成桧烯的基因工程菌；并用该菌株在含有合适碳源、氮源及其他生长因子的条件下，发酵生产桧烯。本发明可用于大规模发酵生产桧烯。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

桧烯(C₁₀H₁₆)是一种天然的双环单萜，可以从多种植物精油中分离得到。桧烯是一种重要的高密度燃料前体，可以作为航空燃料的添加剂，在医药、食品、能源等领域中，桧烯都具有重要的应用前景，近年来受到人们越来越多的关注。桧烯在植物中的含量非常低，从植物中提取需要耗费大量的植物材料，经济成本较高，既费时费力又破坏环境，远远不能满足市场的需要。

随着合成生物学的不断发展，以微生物作为细胞工厂合成桧烯成为一种可持续、快速、绿色的生产方法。然而，目前，在微生物细胞中生产桧烯并不理想，利用微生物生产桧烯一直缓慢前行，未能实行工业化生产。现有报道，在大肠杆菌(Escherichia coli)中以游离的方式表达桧烯合成酶，利用葡萄糖生产桧烯，产量最高达到82.18mg/L(Zhang H,LiuQ,Cao Y,Feng X,Zheng Y,Zou H,Liu H,Yang J,Xian M.2014.Microbial production ofsabinene—a new terpene-based precursor of advanced biofuel.Microbial cellfactories.13:20)。但是，以质粒形式存在的游离基因在发酵过程中不稳定，易丢失，不利于大规模的发酵生产。

除大肠杆菌外，酿酒酵母是生产萜烯类产品的优良菌株。酿酒酵母具有成熟的真核表达系统，拥有天然的甲羟戊酸(MVA)途径，为异源萜类化合物的合成提供了直接前体香叶基焦磷酸(GPP)，因此酿酒酵母细胞具有合成异源萜类化合物的天然优势。目前，Igneaet al.以半乳糖为碳源在酿酒酵母中生产桧烯，最高产量为17.5mg/L(Ignea C,PontiniM,Maffei ME,Makris AM,Kampranis SC.2014.Engineering monoterpene production inyeast using a synthetic dominant negative geranyl diphosphate synthase.ACSSynth Biol 3(5):298–306)。然而半乳糖价格较高，发酵成本过高，不适于大规模发酵生产，这就限制了其应用。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明通过CRISPR-Cas9系统对酿酒酵母基因组进行编辑，导入经过密码子优化的桧烯合成酶基因SabS1，使上述基因整合到酵母染色体，通过该基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1C中异源过量表达，将GPP转化成桧烯从而实现桧烯的生物合成。

一种合成桧烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了GAL80基因，含有经过密码子优化的桧烯合成酶基因SabS1，GenBank登录号为DQ785794.1，其序列如SEQ1所示，所述桧烯合成酶基因SabS1整合在该酵母菌株染色体GAL80位点。

优选地：