[发明专利]一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种合成桧烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了GAL80基因，含有经过密码子优化的桧烯合成酶基因SabS1，GenBank登录号为DQ785794.1，其序列如SEQ1所示，所述桧烯合成酶基因SabS1整合在该酵母菌株染色体GAL80位点；所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1C，基因型为MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2。

2.根据权利要求1所述的一种合成桧烯的基因工程菌，其特征在于，所述酵母菌还含有如下序列：

桧烯合成酶基因SabS1的启动子-GAL1启动子，记为P_GAL1，其序列如SEQ2所示；

桧烯合成酶基因SabS1的终止子-CYC1终止子，记为T_CYC1，其序列如SEQ3所示；

GAL80基因的起始密码子上游的511bp，记为GAL80US，其序列如SEQ4所示；

GAL80基因的终止密码子下游的501bp，记为GAL80DS，其序列如SEQ5所示。

3.权利要求2所述的一种合成桧烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括如下步骤：

(1)将GAL80基因的起始密码子上游的511bp，与终止密码子下游501bp以及P_GAL1-SabS1-T_CYC1片段连接，构建供体DNA片段：GAL80US-P_GAL1-SabS1-T_CYC1-GAL80DS；

(2)将pML04质粒用限制性内切酶SwaⅠ和BclⅠ进行双酶切，获得线性化的pML104质粒；

(3)以序列TAAGGCTGCTGCTGAACGT为靶标序列，构建gRNA的表达片段；

(4)将步骤(1)-步骤(3)所述的供体DNA片段、线性化的pML104质粒和gRNA表达片段同时转入酿酒酵母CEN.PK2-1C感受态细胞，得到酵母基因工程菌。

4.根据权利要求3所述的一种合成桧烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，该菌株构建方法包括如下步骤：

(1)先将经过密码子优化的桧烯合成酶基因SabS1连接到商品质粒pESC-HIS，得到重组质粒pESC-HIS-SabS1，通过PCR获得P_GAL1-SabS1-T_CYC1片段；然后将GAL80基因的起始密码子上游511bp、P_GAL1-SabS1-T_CYC1片段、终止密码子下游501bp依次连接到商品质粒pUC19，得到重组质粒pUC19-GAL80US-P_GAL1-SabS1-T_CYC1-GAL80DS，最后通过PCR获得供体DNA片段：GAL80US-P_GAL1-SabS1-T_CYC1-GAL80DS；

(2)将pML04质粒先用限制性内切酶SwaI酶切7h，再加入限制性内切酶BclI酶切4h，将酶切产物通过凝胶回收，获得线性化的pML104质粒；

(3)以靶标序列TAAGGCTGCTGCTGAACGT为中心，分别构建与质粒pML104同源的gRNA表达片段的上下游两个片段，再通过重叠PCR将两个片段融合到一起获得完整的gRNA表达片段；

(4)将步骤(1)-步骤(3)所述的供体DNA片段、线性化的pML104质粒和gRNA表达片段同时转入酿酒酵母CEN.PK2-1C感受态细胞，培养后获得酵母基因工程菌，其中用量为：供体DNA片段400-1000ng、线性化的pML104质粒100-150ng、gRNA表达片段200-600ng。

5.权利要求1或2所述合成桧烯的基因工程菌在合成桧烯中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌经一级种子培养基培养后，获得的二级种子接种到二级种子培养基中进行发酵得到桧烯。