[发明专利]一种利用玻璃拉针挑取多能干细胞克隆的方法

说明书

本发明提供了一种无需用到解剖显微镜，只需在普通的倒置显微镜配合玻璃拉针和枪头即可进行多能干细胞克隆挑取的方法。该方法主要包括如下步骤：挑取多能干细胞克隆的玻璃拉针的制备；挑取多能干细胞克隆前的细胞换液和对克隆位置的标记；利用玻璃拉针从其他细胞和培养板中剥离出多能干细胞和利用200μL枪头吸取多能干细胞克隆。该方法简便易行，对于普通实验室可以节省购买解剖显微镜的成本。同时本发明提供的方法也适用于胚胎干细胞克隆的挑取和去除干细胞中分化的或者不纯的细胞，能作为一种纯化干细胞株，建立均一的、高纯度和高品质的干细胞株的方法。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种利用玻璃拉针挑取多能干细胞克隆的方法及其应用。

背景技术

成熟的体细胞可以通过异位表达关键的转录因子在称为诱导多能性的过程中重编程为多能状态。所产生的诱导多能干细胞(iPSCs)具有无限的增殖潜力，同时保持着能分化成任何细胞类型的潜能。这些多能性特征使iPS细胞能用于建立许多人类疾病的体外模型，用于发现治疗人类疾病的药物，并且有用作再生医学的无限细胞来源的潜在可能性。

iPSCs在新药筛选，体外疾病模型的建立，细胞替代性治疗以及再生医学方面具有广泛的应用前景。在诱导体细胞形成诱导多能干细胞克隆后，需要挑取多能干细胞的单克隆，以建立稳定的多能干细胞株。目前挑取iPSCs克隆的方法主要是通过在解剖显微镜下挑取克隆的。本发明提供了一种无需用到解剖显微镜，只需在普通的倒置显微镜配合玻璃拉针和枪头即可进行多能干细胞克隆的挑取，该方法简便易行，对于普通实验室可以节省购买解剖显微镜的成本。同时本发明提供的方法也适用于胚胎干细胞克隆的挑取和去除干细胞中的分化细胞或者饲养层细胞，能作为一种纯化干细胞株，建立均一的、高纯度和高品质的干细胞株的方法。

发明内容

本发明提供了一种简便可行的挑取多能干细胞克隆的方法，该方法同时可应用于纯化干细胞株，去除分化细胞和饲养层细胞。

一种简便可行的挑取多能干细胞克隆的方法，包括以下步骤：

(1)挑取克隆所用的玻璃拉针的制备：将玻璃巴氏吸管置于酒精灯上灼烧后拉伸，并将其中部加热向下弯曲至30～90°，制备成玻璃拉针。

玻璃拉针的制备具体包括以下步骤：

a.玻璃巴氏吸管分为管主体部分和圆锥管部分。用左手固定玻璃巴氏吸管主体的一端，用镊子夹住玻璃巴氏吸管圆锥管的一端，并将圆椎管水平地置于酒精灯外焰上方灼烧，边灼烧边旋转，当圆椎管部分受热开始变软融化时，用镊子夹住圆椎管的一端，迅速均匀用力地将巴氏吸管沿着水平方向拉动，同时离开酒精灯外焰，将巴氏吸管圆椎管的一端拉断成细丝状。

b.将步骤a中处理后的巴氏吸管圆椎管拉断的末端在酒精灯上烧结成细小的圆球状，封闭巴氏吸管圆锥管一端的管口。

c.将步骤b中处理后的巴氏吸管在距离圆锥管末端的6～8cm处，将所述管体与酒精灯水平放置，且置于酒精灯外焰上方；将所述管体进行加热至其受热部分向下弯曲至30°～90°；至此即实现了玻璃拉针的制作。

(2)挑取多能干细胞克隆前的准备：在挑取克隆前需要先更换细胞的培养基，并对所需挑取的克隆在显微镜下进行拍照和标记。

具体包括以下步骤：

a.将培养多能干细胞的培养板中的培养基更换成新鲜的干细胞培养基，有利于维持干细胞在挑取克隆时的细胞状态，并有利于提高挑取克隆后克隆的存活率。

b.同时，在挑取克隆前，将用明胶或基质胶预处理过的培养板(用于后续的克隆的培养)中加入新鲜的干细胞培养基。

c.在挑取克隆前，应先在显微镜下找到需要挑取的克隆进行拍照，在培养板的板底用记号笔在克隆的附近做上标记，以便于挑取克隆时确定克隆的位置。