[发明专利]一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及融合His标签植物蛋白的原核表达、变性纯化及复性方法。本发明方法包括1)目的蛋白原核表达载体的构建；2)目的蛋白表达条件的优化；3)大肠杆菌总蛋白的提取；4)目的蛋白与Ni beads(镍珠)的结合；5)杂蛋白的去除；8)目的蛋白复性；7)目的蛋白洗脱。本发明方法适合于易形成包涵体或可溶性差的所有植物SPX蛋白，适用性广，操作便捷，耗时短，所得的蛋白纯度高，复性效果较好，能够成功实现对低可溶性植物SPX蛋白的快速、高效纯化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及融合His标签植物蛋白的原核表达、变性纯化及复性方法。

背景技术

SPX结构域根据Syg1，Pho81以及Xpr1三个蛋白命名而来，存在于多种真核生物蛋白的N端，近期研究表明含SPX结构域的蛋白家族的大部分成员在植物(或者酵母)体内磷信号和磷平衡过程中具有重要生理功能。在大多数植物中，根据是否含有额外结构域的区别，含SPX结构域的蛋白可以分成四个家族。第一个家族即SPX家族指只具有SPX结构域的蛋白；第二家族为SPX-MFS家族，该家族成员除了N端含有SPX结构域，C端同时含有MFS结构域；第三家族为SPX-EXS家族，其所有成员均含有N端的SPX结构域和C端的EXS结构域；第四家族为SPX-RING家族，该家族蛋白除了N端SPX结构域还具有C的RING结构域。本发明的OsSPX1属于第一家族SPX家族。拟南芥和水稻中分别有4个和6个属于第一家族的蛋白即SPX家族蛋白，命名为AtSPX1-4和OsSPX1-6。在这些SPX家族的蛋白成员中，大部分蛋白均得到了不同程度的研究，如拟南芥的AtSPX1和水稻的OsSPX1-5，上述蛋白均得到证实参与了磷信号通路。最近研究表明，SPX蛋白可通过与磷信号通路中心因子PHR2的互作抑制后者的转录功能来负调控磷信号通路。

随着植物分子生物学研究的不断深入和研究水平的不断提高，目前的基因分子功能研究已从DNA水平、转录组水平延伸到了蛋白水平，多种体外生化实验如pull-down、EMSA等已成为必不可少的基因功能验证手段。体外生化实验的开展主要依赖于目的蛋白是否可以在大肠杆菌中得到成功表达并完成后续的纯化。总体而言，SPX结构域在原核表达时，可溶性不高，纯化较为困难。相比较而言，拟南芥SPX蛋白可溶性高于水稻。目前，利用GST标签，已有一些拟南芥及水稻体内的SPX蛋白如AtSPX1，OsSPX1/2/4在大肠杆菌中已经得到表达和纯化。其中，水稻SPX4蛋白(OsSPX4)在为水稻SPX蛋白家族中最易纯化的成员，有研究者利用SUMO标签纯化得到了大量位于OsSPX4蛋白N端的SPX结构域，并成功解析出了该SPX结构域。相比于其它SPX同源蛋白，SPX1蛋白可溶性较差，较难纯化。为提高SPX1蛋白的可溶性，目前的方法一般借助于融合GST或SUMO等可溶性强的标签增加SPX1的可溶性，一定程度上提高了纯化效率。上述方法纯化得到的蛋白量和纯度基本可以满足Pull-down、EMSA等体外生化实验的需要。但上述SPX蛋白纯化方法中使用的均为大分子量的GST或SUMO标签，显著提高了SPX蛋白的错误折叠的风险，加大了体外蛋白实验的操作难度，同时也降低了体外生化实验的可信度。虽然GST或SUMO等大标签可以利用蛋白酶酶切去除，但进行下一步实验前还需借助层析等方法去除残留的蛋白酶，较为繁琐，并且在酶切过程中蛋白稳定性较低造成蛋白降解。同时目的蛋白在和蛋白酶长时间孵育过程中，会发生蛋白发生降解或某些特定氨基酸序列(如信号肽等)一并切除的情况，从而影响后续实验的开展。因此，为满足更多生化实验需求，如制备抗体等需要更大量的蛋白和更高的纯度，有必要对目前的植物SPX蛋白纯化方法进行改进，提高SPX蛋白的得率和生物活性。

相比于GST、SUMO等大分子标签，His标签只有6-8个氨基酸，分子量较小，对目的蛋白构象影响小，无需切除标签即可进行后续实验，非常适用于SPX蛋白的纯化。但是His-OsSPX蛋白可溶性极差，非变性纯化方法效率极低，且纯度较低。而使用传统的变性纯化方法在复性过程中需要通过透析逐渐降低尿素的浓度，时间久，蛋白易降解、析出，费时费力且纯化效果较差。

发明内容