[发明专利]一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法

权利要求书

1.一种简便、高效的融合His标签SPX蛋白原核表达、纯化及复性的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）目的蛋白His-SPX融合蛋白原核表达载体的构建：

使用的原核表达载体构建方法为限制性酶酶切目的基因片段和所用原核表达载体多克隆位点，用连接酶连接酶切产物；具体操作过程为：PCR扩增目的基因片段，并在PCR扩增过程中引入pET系列原核表达载体多克隆位点中有而目的基因序列中没有的限制性内切酶酶切位点，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，使用与PCR过程中导入位点一致的限制性内切酶酶切回收后的目的基因片段和原核表达载体质粒，凝胶回收试剂盒回收酶切产物，再用DNA Ligation Kit 16℃连接3h至过夜；连接产物使用热激法转化进入大肠杆菌BL21菌株感受态细胞中，并挑选阳性克隆；

2）目的蛋白原核表达条件的优化：

目的蛋白原核表达优化条件为：按1:50比例稀释新鲜的阳性克隆过饱和菌液于LB培养基中，摇床37℃、220 rpm震荡培养至OD600 至0.5-0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度100µM，摇床30℃、150 rpm震荡培养8h；

3）大肠杆菌总蛋白的变性提取：

大肠杆菌总蛋白提取方法为：离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2-3遍，用漩涡搅拌器重悬菌体于抽提缓冲液Extraction Buffer中，1g湿重菌体/10ml抽提缓冲液，用超声仪于冰水混合浴低温条件破碎至菌液澄清，离心，吸取上清；沉淀部分再次重悬于5ml 抽提缓冲液中，用超声仪于冰水混合浴低温条件破碎，离心，吸取上清，合并两次上清；

4）目的蛋白与Ni beads的结合：

His-SPX融合蛋白与Ni beads结合方法为：将步骤3）中得到的蛋白上清加至已预平衡的镍珠柱中，上下轻柔颠倒镍珠柱，使蛋白上清与镍珠充分混匀，置于360°旋转摇床中，4℃，最低速，旋转孵育1-2小时；

5）杂蛋白的去除：

杂蛋白去除方法为：取出孵育后的镍珠柱，将柱子竖直静置，待镍珠沉淀于柱子底部后打开柱子上下盖，让液体自由滴下，待液体流出约一半时，盖下盖，从柱子上方加入漂洗缓冲液，盖上盖，上下轻柔颠倒柱子至镍珠与溶液混匀，竖直静置柱子，待镍珠沉到柱子底部，打开上下盖，让液体自由滴尽，重复漂洗操作3次；

6）目的蛋白融合蛋白复性：

所用蛋白复性方法为：待漂洗缓冲液流尽后，往柱子里加入20ml蛋白复性缓冲液，上下轻柔颠倒柱子，直至镍珠与蛋白复性缓冲液充分混匀，置于360°旋转摇床，4℃，最低速，旋转孵育30min；孵育结束后，将柱子竖直静置5min，待镍珠沉降到柱子底部之后打开上下盖，流尽液体；

7）目的蛋白融合蛋白洗脱：

所用蛋白洗脱方法为：步骤6）流尽液体后，盖下盖，加入5ml 平衡缓冲液，上下轻柔颠倒柱子，直至镍珠与蛋白复性缓冲液充分混匀，打开下盖，流尽液体；盖下盖，沿镍珠柱内壁加入2ml 洗脱缓冲液，轻柔晃动柱子，使镍珠与洗脱缓冲液充分混合，静置2min，打开下盖，收集流出的液体，重复收集4-5次，所述蛋白为SPX家族蛋白包括拟南芥和水稻体内的SPX蛋白AtSPX1-4和OsSPX1-6，所述步骤1）中所使用的原核表达载体为含His标签并能够使融合His标签后的SPX蛋白高水平表达的pET系列原核表达载体，所述的步骤3）、5）、6）和7）中所用缓冲液配方为：

抽提缓冲液：

50mMNa₂HPO₄ ，pH= 8.0

8M 尿素

5% 甘油

300mM NaCl

5mM 咪唑；

漂洗缓冲液：

50mM Na₂HPO₄ ，pH= 8.0

300mM NaCl

0.1% Triton X-100

20 mM 咪唑

1 mM DTT；

蛋白复性缓冲液：

50mM Tris-HCl，pH=8.0

150mM NaCl

0.1% Triton X-100

10 mM DTT

5% 甘油

1mM PMSF；

平衡缓冲液

50mM Tris-HCl，pH=8.0

10mM 咪唑

5% 甘油；

洗脱缓冲液

50mM Tris-HCl，pH=8.0

500mM 咪唑

5% 甘油。