[发明专利]一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，本发明利用CRISPR/Cas9系统构建了基于HEK293细胞、可稳定传代、适应悬浮培养、并可应用于重组蛋白表达的谷氨酰胺合成酶缺陷型细胞株HEK293‑GS‑/‑。本发明所述细胞株可以通过GS/MSX筛选系统筛选表达各种重组蛋白的工程细胞株。基于HEK293‑GS‑/‑构建的细胞株经多次传代后能稳定表达目的蛋白；所构建的细胞能够适应大部分的商业无血清培养基；筛选后的细胞自身高表达谷氨酰胺合成酶，从而大大简化了上游培养工艺。HEK293‑GS‑/‑既可以应用于分子生物学、细胞生物学等研究领域，也适合构建应用于生物制药领域的工程细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种筛选谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型HEK293细胞株的方法和基于所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株筛选表达重组蛋白细胞株的方法。

背景技术

蛋白修饰(post-translational modifications,PTMs)在蛋白活性、稳定性和免疫原性方面起着至关重要的作用，直接影响重组蛋白类药品的药效、半衰期和抗药性。未来药品升级、新药开发必然关注在PTMs和人自身蛋白的相似性上。使用人源细胞生产重组蛋白是解决PTMs差异性的捷径。

HEK293细胞来源于人胚胎肾脏细胞，通过转染腺病毒5基因得以永生化。转染后的HEK293细胞株基因组携带腺病毒5E1区域，表达可以使细胞永生化的E1A和能抑制病毒介导的细胞杀伤的E1B两个基因。HEK293细胞生长迅速、操作简单、转染效率高、高表达外源蛋白，因此广泛应用于细胞信号通路研究、重组蛋白表达、病毒载体制备、药品研发等领域，是用途最广、最成熟的人源细胞系之一。近些年，HEK293的细胞培养工艺发展迅速，知名试剂公司如Invitrogen、Hyclone、Lonza、Millipore、Xell、PAN-BIOTECH等都开发出针对HEK293细胞优化的无血清培养基，多个实验组成功实现高效转染无血清培养基悬浮培养的HEK293，从而进一步推动了HEK293细胞在科研及产业内的应用。另外，基于(1)HEK293在免疫缺陷型老鼠的低致瘤性，符合药品安全需求；(2)现有用于药品研发生产的工程细胞系在蛋白修饰方面的功能局限性，如CHO细胞无法满足Drotrecoginalfa(重组人活化蛋白C)的前导肽断裂以及谷氨酸残基的γ-羧化两种PTM修饰；(3)HEK293在病毒载体制备方面的不可取代性等三个主要原因，美国FDA于2001年发布公告，允许基于人腺病毒5E1区域永生化的HEK293用于疫苗和生物制药生产，并于2004年在Vaccine Cell Substrate Conference会议上讨论通过了HEK293作为药品开发细胞株的使用规范。截至2016年，美国FDA已经通过两个基于HEK293细胞生产的蛋白药物，分别是由Biogen idec公司研制的重组人凝血因子VIII(ELOCTATE)和重组人凝血因子IX(ALPROLIX)。得益于人源HEK293细胞在PTM上与人自身蛋白相似的优点，这两种药物在药效，半衰期及耐药性上都有了极大的提升，如ELOCTATE的半衰期长达19.7小时而且临床三期结果显示受试者体内没有检测到中和抗体(34.5％使用CHO生产的凝血因子VIII产生中和抗体和耐药性)。此外，其它制药公司也积极开发基于HEK293平台生产的重组蛋白类药物，如Octapharma公司基于HEK293细胞开发长效重组人凝血因子VIII和重组粒细胞集落刺激因子(rG-CSF)。HEK293在生物制药领域的重要性日趋显现。近年来，基于人源HEK293生产的蛋白类药物陆续通过FDA认证，并在药效学、稳定性等方面优于过往已上市同类药品。可以预知未来重组蛋白药物的研发生产上，HEK293细胞必然成为重要的技术平台之一。