[发明专利]一种能检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢沙门氏菌的PCR引物及方法

说明书

本发明公开了一种能检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢沙门氏菌的PCR引物及方法。根据沙门氏菌靶标序列(SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3)，筛选设计了一对特异性引物，包含引物SEEP‑F和引物SEEP‑R，其中，SEEP‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；SEEP‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。该方法是用上述的引物，对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；扩增产物大小为590bp，则样本中含有或候选含有鸡白痢沙门氏菌；扩增产物大小为1394bp或1400bp，则样本中含有或候选含有其它沙门氏菌。本发明能快速检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢沙门氏菌，与传统的沙门氏菌培养、生化鉴定及鸡白痢沙门氏菌鉴定方法相比更快速、简便，成本更低。

技术领域

本发明属于PCR检测技术领域，具体涉及一种能检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢沙门氏菌的PCR引物及方法。

背景技术

沙门氏菌是具有重要公共卫生学意义的人畜共患病原菌，目前已报道的血清型超过2500个。鸡白痢沙门氏菌可引起鸡白痢，对雏鸡具有较高的死亡率，给规模化鸡场带来严重的经济损失。鸡白痢沙门氏菌主要流行于2-3周龄的雏鸡，但目前出现了易感日龄增大和临床病型多样化的趋势，导致整个养鸡周期都受本病的危害。鸡白痢病雏常表现瞌睡、虚弱和食欲丧失，聚成一团，两翅下垂，排便时会发出尖锐的叫声，在肛门及周围常附有粉白色或绿色的排泄物，可造成雏鸡20-30％的死亡率。在育成鸡中可引起10-20％的死亡率，病鸡多为病雏未彻底治愈后转为慢性，或育雏期间感染所致。成鸡不表现急性感染的特征，常表现为无症状感染。沙门氏菌中的肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等可通过卵巢、输卵管污染鸡蛋，在肠道内定植的沙门氏菌，在加工胴体时污染鸡肉，沙门氏菌进入人类食物链，已成为各国引起人食物中毒致死亡的重要病原。

按照国家标准“食品微生物学检验沙门氏菌检验(GB4789.4—2016)中提出的沙门氏菌分离培养方法较为繁琐、费时费力，报告检验结果大致需4-7天。目前种鸡场主要采用全血平板凝集试验监测鸡白痢沙门氏菌抗体，但该方法需要大量的人力物力，且假阳性较高，常受到人为操作等影响。《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》提出到2015年鸡白痢沙门氏菌在全国祖代以上种鸡场达到净化标准，到2020年全国所有种鸡场达到净化标准。亟需建立快速、准确的鸡白痢沙门氏菌鉴定方法，对促进种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化具有重要意义。

随着分子生物学技术的发展，PCR方法已成为快速检测病原体的有效手段。目前与鸡白痢沙门氏菌有关的PCR检测方法涉及6项专利。其中《沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴定试剂盒》(授权号CN201310110380)、《鉴别鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法》(申请号201510570362.9)中涉及的鸡白痢沙门氏菌检测引物也能扩增出Wandsworth、Manchester、Chester、Java、Bareilly等多个沙门氏菌血清型，特异性不佳；《鸡白痢沙门氏菌的PCR检测引物及检测方法》(申请号201410492056.3)和《一种鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒》(申请号201611111312.5)选取的检测鸡白痢沙门氏菌的基因ipaJ也存在于猪霍乱沙门氏菌中，且该基因定位于小质粒上，并非所有鸡白痢沙门氏菌均携带，易出现漏检的情况；而《一种快速鉴定特定血清型沙门菌的PCR检测试剂盒》(申请号201610459944.4)、《一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒》(201610628075.3)中选取的tcpS、flhB基因均非鸡白痢沙门氏菌特有，检测结果无法准确判定为鸡白痢血清型。文献《鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的建立与应用》(畜牧兽医杂志,2011,30(6):23-27)中涉及的fliC也并非鸡白痢血清型特有，易出现肠炎等血清型的干扰。

因此，需进一步对沙门氏菌及鸡白痢沙门氏菌进行全基因组比对，筛选出沙门氏菌及鸡白痢沙门氏菌特有基因，进而设计特异性引物，为种鸡场沙门氏菌及鸡白痢沙门氏菌的监测提供一种快速简便的PCR检测方法。

发明内容