[发明专利]人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

说明书

本发明涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化LAG‑3基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术领域

本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化LAG-3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。

淋巴细胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)属于免疫球蛋白超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成，是目前已经确定的T细胞抑制性受体之一。LAG-3主要表达在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞上，通过与其配体组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ)结合，负调控T细胞功能。

已有证据表明，LAG-3在多种免疫应答类型中发挥了重要调控作用，特别是在肿瘤免疫中。LAG-3在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中异常表达，且与多项病理参数和预后密切相关。LAG-3抑制剂或阻碍其信号通路能增强特异性CD8+T细胞的抗肿瘤作用。此外，联合阻断LAG-3和PD-1可能是通过增加效应T细胞的比例起到减缓肿瘤生长的协同作用。可见抗LAG-3治疗联合其它多个信号分子，在临床上对改善肿瘤免疫治疗疗效具有应用价值，可能是今后研究的重要方向之一。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前与LAG-3相关的实验动物很少。Toru Miyazaki(1996)等人利用同源重组技术，将小鼠Lag-3基因上1-3号外显子用新霉素抗性基因替换，制备出Lag-3基因敲除小鼠。该小鼠NK细胞功能受损，对靶细胞的杀伤作用减弱或消失。进一步的研究证实该小鼠抗原特异性CD8+T细胞增殖增加；CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较野生型增加，但两者比值未观察到明显变化。此外，该小鼠制备过程中使用的胚胎干细胞(ES细胞)来源于129遗传背景的小鼠，得到嵌合鼠后需与C57BL/6进行多次回交。该方法缺陷在于：一般需要超过10代的回交才能获得纯合子，回交往往需要2年的时间，耗费时间、资金和科研精力；另一方面，回交次数不同也会造成试验结果重复性差。

由于目前的模型小鼠存在上述缺陷，且LAG-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本发明在世界范围内首次提供一种建立人源化LAG-3基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例LAG-3基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达LAG-3蛋白，且表达的LAG-3蛋白能识别并结合人LAG-3抗体/抗原。此外，使用本方法制备的LAG-3基因人源化动物还可与其它基因改造人源化动物交配，得到双人源化或多人源化动物模型。本方法在肿瘤药物筛选等方面有着广阔的应用前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物LAG-3基因的特定片段被人LAG-3基因特定片段替换，本发明成果得到世界首例LAG-3基因人源化小鼠。成功制备LAG-3基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达LAG-3嵌合蛋白，可用于LAG-3基因功能研究、靶向LAG-3人源抗体的筛选和评价。

利用本发明制备的动物模型可用于针对人LAG-3靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究LAG-3蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。