[发明专利]CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法

说明书

本发明提供了CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其能解决现有构建方法操作要求以及试剂配制要求较高受，普通技术人员获得的菌株阳性率低，阳性菌株挑选费时费力的技术问题。CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框（ORF）、启动子和终止子。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，特别涉及CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法。

背景技术

CRIPSR/Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术，广泛应用于各类体内和体外体系的遗传学改造、转基因模式动物的构建，甚至基因治疗领域。在利用CRIPSR/Cas9系统进行基因编辑操作时，需要选定一种sgRNA的供给形式。以对哺乳动物细胞的基因编辑为例，可使用质粒或病毒为载体表达sgRNA，也可以在体外将sgRNA生产纯化出来后，直接转染进细胞实行功能。当然，以何种形式导入sgRNA取决于实验需要以及细胞本身的特性，但在通常情况下直接将sgRNA构建于表达载体之上更为经济和便捷。特别是可同时表达优化的Cas9蛋白及sgRNA的All-in-one载体的出现使得研究者们能够更加轻松的利用单个质粒实现基于CRIPSR/Cas9系统的基因编辑[Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, HabibN, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.Multiplex Genome Engineeringusing CRISPR/Cas-systems.Science 339,819-823(2013).]。

在sgRNA骨架载体的构建过程中，最为重要的一步是质粒的线性化。几乎所有的sgRNA骨架载体都会利用识别位点和切割位点不一致的IIS型内切酶，使得sgRNA寡核苷酸单链退火配对之后能够无缝插入。然而常用的IIS型内切酶如BsmBI等酶切效果并不充分。为解决这一问题，一些载体，例如pX330，其在使用过程中往往会在两个反向的IIS型内切酶的酶切位点之间加入区分片段，从而可以通过胶回收的方法将线性化的载体和空质粒加以区分。尽管这一手段是有效且必要的，然而在实际操作中假阳性的产生依旧无法避免，尤其在胶回收过程中，对操作要求以及试剂配制要求较高，普通技术人员回收的线性化质粒中参杂了未充分酶切的载体，在与退火形成的具有粘性末端的sgRNA短双链DNA片段进行连接后，由于残留的少数空质粒转化效率要远远超过连接产物，因而转化大肠杆菌涂板后长出的大部分克隆都是含有空质粒的假阳性转化子，阳性率很低，往往在10%左右，需要挑较多的单克隆进行菌落PCR鉴定才能得到阳性克隆，费时费力。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其能解决现有构建方法操作要求以及试剂配制要求较高受，普通技术人员获得的菌株阳性率低，阳性菌株挑选费时费力的技术问题。

其技术方案是这样的，CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：

（1）制备线性化的sgRNA空质粒，采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，所述sgRNA空质粒通过IIS型内切酶进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒；

（2）制备区分片段，所述区分片段两端具有与IIS型内切酶酶切后对应的末端片段；

（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段连接，制备重组sgRNA骨架载体；

（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的sgRNA骨架载体转化大肠杆菌，涂抗性平板，形成单克隆，挑单克隆用含有所述IIS型内切酶酶切位点接头的引物进行菌落PCR鉴定；