[发明专利]一种评价玉米抗黄曲霉侵染能力的田间鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术领域，特别是涉及玉米黄曲霉的田间接种方法及评价抗黄曲霉侵染能力的鉴定方法。

背景技术

我国是玉米种植大国，不同生态区的玉米生育进程与气候资源差异较大。黄淮海玉米成熟期间雨热同步，特点是温度高、湿度大，果穗在灌浆及脱水过程中容易遭受黄曲霉污染，在田间容易积累大量黄曲霉毒素，影响玉米品质，危害人畜健康。黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是一类具有相似结构的化合物的总称，是黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、集蜂曲霉(Aspergillus nomius)等曲霉菌产生的具有生物活性的二次代谢产物，目前已分离出来的毒素分别命名为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等12种，其中B1毒性最强，也是目前为止发现的所有毒性物质中毒性最强的化学致癌物，其毒性远高于氰化物、有机农药和砷化物，是导致肝癌、鼻咽癌的主要病原之一，被国际癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物质。黄曲霉毒素对玉米为原料的食品和饲料构成严重的安全隐患，随着玉米种植面积的扩大，黄曲霉病害爆发可能使粮食安全遭受灾难性后果。

黄曲霉菌为弱寄生菌，完整的玉米籽粒自然条件下不易自发感染，常伴发于病虫侵害。大田玉米果穗黄曲霉菌接种常用方法是将黄曲霉孢子悬浮液和玉米生育过程中的果穗接触致使其感染发病，接种技术分为伤害性和非伤害性两种。伤害性的接种技术包括刀划法、钢针法和排针法等。非伤害性接种法包括黄曲霉孢子悬浮的液顶部注射、喷洒花丝和花丝通道注射法等。Henry,W.B于2010年用试验比较了格鲁吉亚和密西西比州两种接种技术(侧针和刀划)和不同接种率。密西西比州的研究中使用侧针技术。侧针法使用装有14号针头的树标记枪在授粉七天后的果穗上接种，针穿过苞叶插入果穗中，注射黄曲霉孢子悬浮液。在格鲁吉亚地区的研究中采用刀划法，使用一个6.4cm刀片的普通削皮刀。果穗授粉后14天，用接种刀蘸取黄曲霉孢子悬浮液，接种刀插入苞叶中，这种技术通常会损伤3～5粒籽粒。

国外田间接种方法在黄曲霉接种时间、果穗部位和接种方式等方面差异较大，发病效果迥异，重复性不佳，严重影响科研准确性。此类接种法均难以做到精确定量接种黄曲霉孢子，后期统计结果也缺乏准确性。有些接种法的接种部位一般是在穗尖部易感区，中下部的感染往往被忽略。而诸如花丝喷施等方法更是无法直接作用于籽粒，很难有明显直接的致病关系。国内在实验室研究玉米籽粒致病机制及抗性机理的研究较多，大田研究方法主要参考花生的接种方法，目前尚未见报道完整可行玉米黄曲霉抗性研究方法。

发明内容

为了克服国内外现有技术的不足，提高田间研究玉米抗黄曲霉侵染发病稳定性和精准性，高效鉴定玉米种质的抗性能力。本发明提供了一种简单、高效的检测玉米黄曲霉抗性能力的鉴定方法，即三点螺旋接种法：玉米雌穗授粉后使用刻度注射器，在玉米穗上、中、下三个部位分别接种孢子悬浮液，针头斜刺入玉米穗苞叶内，刺破单颗籽粒，螺旋接种，使三个接种点螺旋向下等距分布。所采用的技术方案是：

1)在察氏固体培养基上接种黄曲霉菌(编号：3.4410，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，30℃培养7天，生长后产生黄曲霉菌孢子；

2)使用灭菌蒸馏水将黄曲霉菌孢子洗脱，制备成黄曲霉菌孢子悬浮液，浓度为1.0×106个/ml；

3)玉米雌穗授粉15～20天内，在每天相同时间段，利用刻度注射器将黄曲霉孢子悬浮液45度斜刺入玉米穗苞叶内，要求刺破籽粒，在玉米穗上中下三个部位分别旋转接种0.5ml孢子悬浮液。

4)各玉米自交系同时在接种第40天收获全部果穗，测量黄曲霉菌侵染的发病面积以区分级别。

5)玉米果穗晒干后，以每个接种点为中心向周围辐射取样，每个接种点取样4g，每个果穗取样12±0.1g。以粉碎粉末进行黄曲霉毒素B1的定量检测。与现有技术相比，本发明“三点螺旋接种法”的有益效果在于：

1.本发明实施条件为自然环境，黄曲霉侵染果穗的过程受自然环境影响，符合大田试验要求。

2.玉米材料接种发病过程的关键步骤皆有调控标准，如接种黄曲霉孢子悬浮液等量可控，接种部位分布合理，接种后黄曲霉菌侵染时间相同，发病条件为自然环境，符合基因型为唯一差异的研究原则。

3.本方法试验重复性好，同一玉米自交系的发病面积无显著差异，保证了试验重现性，降低了系统误差。

4.本方法有效避免了果穗上中下三部位籽粒由于含水量差异造成对玉米抗侵染能力的误判，采用三点平均值法计算发病面积和毒素含量。