[发明专利]一种靶向富集高GC含量目标DNA的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于目标序列捕获和多重置换扩增的靶向富集高GC含量目标DNA的方法以及适于该方法的试剂盒。本发明还涉及基于该富集方法构建高GC含量DNA测序文库的方法。

技术领域

本发明涉及针对高GC含量目标DNA的富集方法，该方法尤其适用于高GC含量序列的测序文库的构建，例如在高通量、长读长的测序方法中所用的测序文库。本发明还涉及用于上述方法的试剂盒。

技术背景

基因组中富含GC的区域往往与基因表达的调控、染色体结构的变化以及遗传病等都有着密切的关系^[1]。由于高GC区的G-C碱基互补配对形成的发夹状二级结构较为稳定，对高GC含量DNA区域(一般GC含量等于或大于80％)的准确测序一直以来存在技术上的困难和挑战。

虽然以Sanger测序、毛细管电泳等为代表的方法当前在高GC含量DNA的检测中被使用^[2,3]，但这些方法基本上都是建立在聚合酶链式反应(PCR)的基础之上的，而PCR往往难以对高GC含量DNA，特别是完全由C/G碱基组成的区域进行有效扩增^[4]。尽管人们已在改造DNA聚合酶、优化引物设计、优化PCR反应温控条件、使用能够减少DNA二级结构的PCR促进剂(如二甲基亚砜、甜菜碱等)等多个方面做出了努力，并且一定程度上也提高了高GC含量DNA的扩增效率^[5-8]，但结果并不是十分稳定，因为扩增效果往往取决于DNA模板分子序列和组成的复杂程度。此外，即便是通过PCR扩增获得了高GC含量DNA的少量产物并用高分辨率的毛细管电泳进行检测，该方法也只能检测产物的大小和丰度，无法获得DNA的碱基序列；而能读取DNA序列的Sanger测序技术和第二代高通量测序技术仍然都是基于PCR原理进行的，对高GC区的测序依然存在无法准确读取，甚至测序过程中断等诸多问题。

综上，针对高GC含量DNA序列的检测主要包括两个方面的技术关键：(1)高GC目标区域的靶向建库或富集；(2)高GC目标区域的测序。先前Loomis等人已经采用单分子实时测序(SMRT)技术对含有高达750个CGG重复单元的目标DNA序列进行了测序^[9]；这得益于近年来发展的以单分子实时测序和纳米孔测序为主要代表的第三代高通量测序技术的诸多优势，其不仅能够读取更长的读长，而且测序过程无需PCR环节即可对单分子直接进行测序，避免了因PCR而导致的高GC区域测序的限制，真正实现测序覆盖的完整性^[10]。然而，Loomis等人方法中用于测序的高GC含量目标DNA，是通过克隆质粒和PCR扩增两种方式获得的^[9]，克隆质粒的方法费时费力，而PCR扩增依然也面临扩增效率低和扩增错误倾向的问题。此外，Pham等人最近也报道了一种不依赖于扩增或富集的方式对高GC目标DNA进行三代测序的方法：用IIS型限制性内切酶处理基因组DNA，然后连接含特异序列的发夹状接头，再经核酸外切酶处理保留含完整接头连接DNA的分子，最后用含特异序列的SMRThook引物进行靶向测序^[11]。但是，Pham等的这个方法^[11]也存在几个明显的问题，例如：Pham等人所用的限制性内切酶^[11]消化后片段的长度一般是几百个碱基，对较长片段(如kb级以上的)目标DNA的连续测序可能会存在一定的困难；而且该方法因未有模板DNA的富集或扩增过程，所以对起始DNA的含量要求较多。

鉴于第三代测序平台可以很轻松且准确地对高GC含量DNA进行测序^[10]，那么现在需要解决的问题主要是如何准确高效地靶向富集从而获得满足测序平台要求的高GC含量的目标DNA。

靶向富集首先需完成目标区域的定向分离，而现在比较成熟的目标序列捕获技术，可根据基因组目标区域的序列设计合成特异性探针与基因组DNA杂交，从而实现目标序列的定向分离^[12]。