[发明专利]miR‑199a‑5p的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种miR-199a-5p的模拟物和一种抑制物及后者的重组表达载体及其用途。

背景技术

肝脏是机体的重要器官，具有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病方法等都有重要理论意义和应用价值。

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子。miRNA通过与靶基因mRNA的3′-UTR特定区域的结合引起翻译的抑制或是mRNA的降解。由于miRNA参与调节细胞分化、增殖、凋亡等一系列的重要活动，且在许多疾病和肿瘤的发生发展过程中的作用，因此，越来越多地受到研究人员的高度重视miRNA研究。

研究表明，miR-199a-5p出现于多种生物，能调节TNF-α、VEGFA、mTOR、MMP9、CD44、HIF-1α等多个靶基因的表达。其中TNF-α是由巨噬细胞/单核细胞活化产生的一种细胞因子，以三聚体的形式发挥作用。TNF三聚体结合到TNF-R₁的胞外区后，TNF-R₁胞内区上的SODD(silencer of death domain)被释放。随后，TRADD(TNF-R₁ associated death domain protein)的C端死亡结构域与TNF-R₁的死亡结构域结合，形成TNRR_l/TRADD复合体。FADD(Fas associated death domain protein)被招募到该复合体上，FADD的N端MORT结构域进而激活MACH/FLICE(Caspase-8)，被激活的Caspase-8再去激活其他的ICE/CED3蛋白酶。这样，通过caspasse-8蛋白酶的级联放大反应，诱导细胞凋亡。

miR-199a-5p的模拟物体内促细胞增殖的原理是用基因转染的方法将模拟物导入受体细胞，该模拟物与TNF-α的3′-UTR结合，导致TNF-α表达水平降低，从而阻遏TNF-α的促凋亡作用，促进细胞增殖；miR-199a-5p的抑制物体内发挥作用的原理是设计并构建重组载体，其内含有miR-199a-5p的抑制物核苷酸序列，用基因转移的方法将重组载体导入受体细胞，通过载体过表达miR-199a-5p的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列与miR-199a-5p定点结合，从而抑制miR-199a-5p与TNF-α的3′-UTR结合，TNF-α表达水平增加，从而促进TNF-α的促细胞凋亡作用。

发明内容

本发明提供了一种miR-199a-5p的模拟物及抑制物，该模拟物及抑制物可用于调节TNF-α蛋白表达，以及调节肝细胞增殖或凋亡的基础医学和临床医学的研究，有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种miR-199a-5p的模拟物，所述模拟物为SEQ ID NO.1。

本发明还提供了一种能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物，其特征在于，所述抑制物选自TNF-α的3′-UTR中长约700～1000bp区段；所述抑制物与miR-199a-5p的结合位点为CACTGGA。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制物为SEQ ID NO.2。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分别添加限制性酶切位点；优选地，所述限制性酶切位点在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点分别为Xho I和Not I对应的核苷酸序列；所述Xho I酶切位点位于5′末端，所述Not I酶切位点位于3′末端。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素报告酶。

在根据本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体是通过将上述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物连接到报告载体psi-CHECK-2中得到的。