[发明专利]一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质

说明书

本案涉及一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，以吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球为内核，在醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子，其中壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与水杨醛或者水杨醛衍生物缩合连接，该亲和层析介质表面通过配位固载Ni²⁺；通过空间位阻和螯合价位两方面的共同调控，实现对含有4×His‑Tag、5×His‑Tag、6×His‑Tag的重组蛋白的特异性分离纯化；本发明改进方法简单，生产成本低，有利于大规模的推广应用。

技术领域

本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种用于组氨酸标签蛋白纯化的金属螯合亲和层析介质。

背景技术

应用基因重组技术，通过体内或者体外方法能够获得具有特定功能和活性的重组蛋白，经过除杂达到一定纯度标准的重组蛋白可以作为相应医药产品的功能性组分。重组蛋白纯化要求将目标蛋白与其他蛋白、核酸、多糖等成分分离，同时要使目标蛋白的结构保持完整、生物活性保留。随着重组蛋白纯化工艺的发展，亲和标签已经成为重组蛋白纯化的一个重要且有效的工具，其中，由6个连续组氨酸组成的组氨酸标签(6×His-Tag)在蛋白亲和纯化以及免疫检测等领域应用最为广泛。由多个组氨酸组成的肽链(常用6～10个组氨酸)可以与二价金属离子(镍、铜、锌和钴等)之间产生较强的金属螯合作用，从而便于用金属螯合亲和层析纯化重组蛋白质。

目前已经商业化的用于组氨酸标签蛋白纯化的金属螯合亲和层析介质主要包括Ni-NTA Agarose和Ni-IDA Agarose两种配位结合镍离子的琼脂糖凝胶，在纯化过程中，带有组氨酸标签的重组蛋白通过与镍离子(Ni²⁺)螯合配位而吸附停留在凝胶上，杂质成分首先被缓冲溶液洗脱，然后调整缓冲溶液组分及pH值将目标重组蛋白特异性洗脱以达到分离纯化的目的。上述两种配位结合镍离子的琼脂糖凝胶不仅价格昂贵，而且适用范围窄，仅对末端含有6×His-Tag的重组蛋白有较好的纯化效果，在实际应用中，当重组蛋白末端融合6个组氨酸成串的肽段出现困难时，将无法实现有效的纯化。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于组氨酸标签蛋白纯化的金属螯合亲和层析介质。相比于现有技术，通过简单的调控，本发明能纯化含有特定组氨酸标签(4×His-Tag，即4个连续组氨酸组成的组氨酸标签；5×His-Tag，即5个连续组氨酸组成的组氨酸标签)的重组蛋白。

本发明的技术方案概述如下：

以吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与水杨醛或者水杨醛衍生物缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni²⁺；

其中，所述水杨醛衍生物由水杨醛苯环上的氢被供电子基团取代所得。

优选的是，所述水杨醛衍生物为3-羟基水杨醛、3-甲基水杨醛、3-甲氧基水杨醛、4-羟基水杨醛、5-甲基水杨醛、5-甲氧基水杨醛中的一种。

优选的是，当所述氨基三乙酸与水杨醛或者水杨醛衍生物的摩尔比为1∶0.1-0.2时，能有效分离含有6×His-Tag的重组蛋白。

优选的是，当所述氨基三乙酸与水杨醛或者水杨醛衍生物的摩尔比为1∶0.8-1时，能有效分离含有5×His-Tag的重组蛋白。

优选的是，当所述氨基三乙酸与水杨醛或者水杨醛衍生物的摩尔比为1∶1.8-2时，能有效分离含有4×His-Tag的重组蛋白。

水杨醛及其衍生物中苯环上的醛基容易与氨基发生缩合反应生成席夫碱配基，席夫碱对金属具有较强的螯合配位作用，同时苯环会产生一定的空间位阻。席夫碱配基与氨基三乙酸配基的比例通过上述调控，可以对不同组氨酸数目的肽段实现有效筛选。