[发明专利]一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质

权利要求书

1.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，其特征在于，以吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni²⁺；所述亲和层析介质用于特异性分离含有4×His-Tag重组蛋白；根据如下步骤获得所述亲和层析介质：

1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥，以形成吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球；

2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于步骤1)的吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥，从而在所述醋酸纤维素微球的表面键合了壳聚糖分子；

3)取20g步骤2)所得微球、25mL环氧丙氯丙烷、20g氨基三乙酸、50mL的乙醇和5g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联；

4)取20g步骤3)所得微球、28g的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应3～4h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的的氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；

5)将步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥；得到用于特异性分离含有4×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。

2.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，其特征在于，以吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni²⁺；所述亲和层析介质用于特异性分离含有5×His-Tag重组蛋白；根据如下步骤获得所述亲和层析介质：

1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥，以形成吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球；

2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于步骤1)的吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥，从而在所述醋酸纤维素微球的表面键合了壳聚糖分子；

3)取20g步骤2)所得微球、30mL环氧丙氯丙烷、29mL氨基三乙酸、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应6～8h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联；

4)取20g步骤3)所得微球、20g的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应2～3h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的的氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；

5)将步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥；得到用于特异性分离含有5×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。

3.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，其特征在于，以吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni²⁺；所述亲和层析介质用于特异性分离含有6×His-Tag重组蛋白；根据如下步骤获得所述亲和层析介质：

1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥，以形成吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球；

2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于步骤1)的吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe³⁺的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥，从而在所述醋酸纤维素微球的表面键合了壳聚糖分子；

3)取20g步骤2)所得微球、65mL环氧丙氯丙烷、60g的氨基三乙酸、50mL乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应6～8h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联；

4)取20g步骤3)所得微球、8.5g的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和3g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应1～1.5h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的的氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；

5)将步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥；得到用于特异性分离含有6×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。