[发明专利]一种耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及益生菌领域，尤其涉及一种耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法。

背景技术

长双歧杆菌，属于可用于食品中添加的益生菌，主要涉及食品、保健品、日化用品、饲料等产品的应用。益生菌菌粉，尤其通常作为乳酸菌相关的益生菌菌粉在大部分益生菌发酵食品、保健品制剂、生物饲料、医药制剂中所常见的。

益生菌普遍对环境要求较高，对外界耐受性较差，在常温下的长期贮存一直难以保持高活性，使得在产品开发和应用方面具有局限性。目前市场上益生菌虽然以冻干菌粉形式进行供应，但是在微生态制剂产品中普遍出现货架期内储存稳定性严重下降趋势，特别是常温或外环境温度较高的非恒温贮存产品，容易出现短期内活菌数大幅度下滑或骤降等现象。

目前国内产品微生态制剂产品大多处于常温或室温保存，个别地区或存在局部时段温度过高或长期恶劣气候，无法对产品放置条件达到保证，或者在一些需要特殊工艺的产品中需要经过高温长时处理，比如在胶囊、软糖、巧克力等产品制造过程中对产品中活菌造成巨大损失，所以需要一种能提高菌株自身耐受性的筛选方法所获得原料来应对不同产品的开发及应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有高活性、在常温或高温货架期内能显著提高稳定性、并且在人体胃肠道中具有良好的耐酸、耐胆盐及胃肠道粘附性的耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法。

本发明第一方面提供一种耐热型长双歧杆菌，已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10452，分类命名为长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体的，所述耐热型长双歧杆菌在75℃条件下保温30分钟存活率可达到50％以上。

具体的，所述耐热型长双歧杆菌在体外模拟胃酸pH 2.5环境条件下1-2小时内存活率为60-80％。

具体的，所述耐热型长双歧杆菌在体外模拟胆盐高渗透0.3％环境条件下1-2小时内存活率为50-75％。

本发明第二方面提供一种耐热型长双歧杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

S1、样品采集；

S2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温25-45℃培养12-72小时；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、一端有时呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温25-45℃培养12-72小时；

S3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于40-80℃恒温水浴锅进行热激，计时热激5-30分钟，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于MRS培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数30-50次，通过检测其热激前后细胞存活率达到20-40％以上可完成条件初筛，得到耐热型长双歧杆菌，随后进行保藏。

多次高温循环热激条件下进行耐热型菌株的筛选，主要目的是：通过外界亚致死条件，刺激细胞产生热激蛋白，激发菌体自身的非特异性免疫，不断循环筛选，挑选出具有在热激条件下表现出高抗逆性特性的菌株。通过外界的亚致死胁迫，导致菌体趋于抗性的提升，并且保证菌株复苏过程中拥有较高活性。

最优的，步骤S3中，将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于55℃恒温水浴锅进行热激；在该温度将造成细胞亚致死，胁迫细胞在接近致死的条件下刺激产生热激蛋白形成非特异性免疫，进一步筛选具有此能力特性菌株。

最优的，步骤S3中，计时热激15-20分钟；考虑到物料中心温度与边缘温度的差异，以及混合体系介质传热速率等关系设计。最优的，控制物料中心温度达到指定温度后，恒温保存15min。该条件下可防止体系内还原糖与蛋白类成分发生过度非酶褐变反应，造成抑制性产物影响实验设计条件。

具体的，所述样品采集自健康成年人体粪便，传统发酵食品，比如酸牛奶、酸羊奶、奶酪等，以及少数哺乳动物肠道上皮细胞。

具体的，步骤S2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。