[发明专利]一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；裂解液的成分为DNAiso Reagent；扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV2‑F上游引物、PCV2‑R下游引物、PCV3‑F上游引物、PCV3‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；阴性对照为灭菌三蒸水；阳性对照为PCV2和PCV3阳性质粒混合物。该猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，能彻底解决PCV2、PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测。

技术领域

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一种重要的猪病病原，PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、怀孕母猪繁殖障碍和新生仔猪A2型先天性震颤(CT)。1991年Clark首次报道了加拿大猪群中存在PMWS，随后世界许多国家和地区均报道了该病的发生和流行，对养猪业造成了巨大的经济损失。迄今为止，各国学者针对PCV2建立了多种检测方法，对调查PCV2的感染流行情况起到了重要作用。

病毒的分离需要采集病死猪的组织，研磨、冻融、离心后取上清接种于细胞，如无PCV污染的PK-15、猪睾丸细胞(ST)或Dulac细胞等。由于病毒在培养细胞上不出现细胞病变，在病料接种3d后，可通过间接免疫荧光试验(IFA)、免疫组织化学染色法(IHC)、PCR等确认病毒。但病毒分离所需时间较长，不宜作为疾病的快速诊断方法。

免疫荧光试验包括直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验，这两种方法均可对用细胞分离的PCV病毒进行鉴定，也可对病理组织冰冻切片细胞内有无PCV进行检查和定位。免疫荧光试验操作简单，耗时少，适合作为快速诊断的试验方法。

免疫组化技术是应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，可对组织或细胞表面的抗原进行定性、定量和定位。常用的技术有：酶免疫组化(用辣根过氧化物酶标记)、免疫金组化(用胶体金颗粒标记)和免疫电镜技术(用铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记)等。

随着分子生物学技术的兴起与发展，PCR技术以其快速、敏感、易于操作等优点在动物疫病诊断中得到了广泛应用。参照GenBank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列，设计一对PCV2特异引物，如果能从患病猪的病料中扩增PCV2特异的基因组片段，就可以证明存在PCV-2的感染。

2016年，Palinski等首次鉴定并命名猪圆环病毒3型(PCV3)。同年3月，在中国辽宁、江西、重庆的3个猪场检测出了PCV3病原。研究认为，PCV3是一种与母猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍相关的病原，但目前尚未清楚其起源，是否早已存在于猪体中只是未被发现，还是通过跨物种传播或通过PCV间的重组而形成，仍有待进一步探究。自2016年以来，我国部分省(市)相继出现以母猪流产和死亡、断奶仔猪呼吸衰竭和死亡为临床特征的PCV3感染报道。国内有研究从广西腹泻病死仔猪的病料样品中检测出PCV3，表明PCV3不但引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍，还能引起仔猪腹泻。由于PCV3是新发猪群病毒病，目前未见快速检测PCV3病原的公开报道。由于PCV2和PCV3引起猪群发病的症状类似，因此，发明一种快速鉴别PCV2或PCV3感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法，该猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制PCV2和PCV3感染提供有力的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。