[发明专利]用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法和用途

说明书

本发明提供了一种新的用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法，能够用于对牛黄类药材、成方制剂及其他相关产品进行真伪鉴定。本发明还提供了探针引物用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的用途，所述探针引物为SEQ ID NO：1‑3、4‑6、7‑9、10‑12、13‑15和/或16‑18所示的探针引物组，其中SEQ ID NO：13‑15和16‑18为新的探针引物组。所述方法采用荧光定量PCR探针法，检测样品中应有的动物源性成分和不应有的动物源性成分。应用于牛黄类药材、成方制剂及其它相关产品的质量控制，所述方法特异性强、灵敏度高、重复性好。

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及药物鉴别检测方法，尤其涉及一种用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法。

背景技术

天然牛黄为牛科动物牛(Bos taurus domesticus Gmelin)的干燥胆结石，主要含有胆红素、胆汁酸、胆固醇、无机元素、蛋白质及氨基酸等成分，具有清心开窍、凉肝解毒、豁痰息风等功效，是名贵中药材之一[1-2]。由于其资源紧缺，价格昂贵，我国于20世纪50年代中期即开始了替代品即培植牛黄、体外培育牛黄与人工牛黄的研究。

培植牛黄是利用活牛体，以外科手术的方法在牛的胆囊内插入致黄因子，使之生成牛黄。体外培育牛黄是根据胆红素钙结石体内形成的原理和生物化学过程，应用现代生物工程技术，在体外牛胆囊胆汁内模拟体内胆结石形成的原理和生物化学过程，培育牛胆红素钙结石。人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成。

由于人工培植牛黄是在与天然牛黄相同的特定生态因素条件下形成的，经测定其理化特性、性味、色泽、药效成分含量等与天然牛黄无明显差异。而体外培育牛黄在性状、结构、成分和主要成分含量方面与天然牛黄类似。人工牛黄则与天然牛黄差异较大[3-7]。

牛黄在成方制剂中应用广泛，资源短缺，特别是天然牛黄和培植牛黄，生产周期长，产量低，属于珍贵稀有的药材，近来市场上屡屡曝出掺伪造假的情况。为了防止此类现象的发生，迫切需要开发新的检测手段，加强监管，对牛黄类药材的质量进行更好的控制。

发明内容

本发明首次建立了一种用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法，其能够用于牛黄类药材及其相关产品的鉴定。

一方面，本发明提供了一种用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测方法，包括下述步骤：

称取牛黄样品及样品前处理；

从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及

选择探针引物；

优化反应条件；

利用所述探针引物对所述DNA模板进行扩增；

针对扩增结果，根据设定的CT值临界点判定阳性结果；

其中，所述方法能够用于检测所述样品中应有的牛源性成分和不应有的包括猪、马、驴、羊等其他动物来源成分。

在一些实施方式中，所述探针引物选自下述组群中的一组或多组：序列号为SEQID NO 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18的探针引物。其中每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。

在另一些实施方式中，所述探针引物为序列号为SEQ ID NO 13-15和/或16-18的探针引物。在另一些实施方式中，所述探针引物为序列号为SEQ ID NO 1-3、4-6、7-9和/或10-12的探针引物。

在本发明的一种实施方式中，所述样品为牛黄类中药材或含有牛黄的成方制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。