[发明专利]编码NhaA蛋白的核酸的用途以及利用纤维素制备金合欢烯的方法

说明书

本公开提供了编码NhaA蛋白的核酸在制备产金合欢烯的工程菌中的用途。本公开还提供了一种制备产金合欢烯的工程菌的方法。本公开还提供了上述方法制备得到的工程菌。本公开还提供了一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种如上所述的工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。因此，本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。

技术领域

本公开涉及生物工程领域，具体地，涉及编码NhaA蛋白的核酸在制备产金合欢烯的工程菌中的用途、一种制备产金合欢烯的工程菌的方法、该方法制备得到的工程菌以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。

背景技术

金合欢烯可加氢转化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料。金合欢烯具有不含硫、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的生物基化学品。例如，CN101553558A描述了在大肠杆菌中利用含有葡萄糖的培养基通过MEV途径生成金合欢烯。

通过微生物法生产金合欢烯需要解决的一个重要问题是葡萄糖的来源问题。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上，是一种重要的葡萄糖来源。具体地，纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键联结而成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。例如，棉花的纤维素含量接近100％。纤维素通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起。例如一般木材中，纤维素占40～50％，还有10～30％的半纤维素和20～30％的木质素。

纤维素只有在降解为葡萄糖以后，才能被微生物工程菌作为碳源利用。在实际生产中，作为纤维素的来源的原材料主要包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸等，这些原材料中纤维素往往形成一种具有高度结晶区的超分子稳定结构，同时其周围紧密镶嵌着半纤维素和木质素，从而形成复杂稳定的结构，其使得纤维素很难直接被微生物直接利用。目前，通常对作为纤维素的来源的原材料先进行预处理和酶解，在将得到的含有单糖的产物送入发酵过程。例如，已有的预处理方法主要有稀酸处理、热液处理、蒸汽爆破、有机溶剂处理、低温氨浸处理、碱液处理、碱性过氧化氢处理和生物法处理等。又例如，已有的酶解包括纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶的酶解。

然而，在研究过程中发现，纤维素水解产生含有单糖的产物如果用于金合欢烯的发酵生产，存在着产率低下的缺陷。

发明内容

本公开的目的之一是提高利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。

为了实现上述目的，一方面，本公开提供了编码NhaA蛋白的核酸在制备产金合欢烯的工程菌中的用途，其中，所述NhaA蛋白为如下(a)或(b)的蛋白：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有NhaA蛋白活性的由(a)衍生的蛋白。

另一方面，本公开还提供了一种制备产金合欢烯的工程菌的方法，其中，该方法包括：通过对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入或染色体整合敲入的改造，使得改造后的工程菌宿主菌能够具有异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)、金合欢烯焦磷酸合成酶(ispA)和金合欢烯合成酶(FG)的表达，并且能够具有组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶或者组成脱氧木酮糖-5-磷酸(MEP)途径的多种酶的表达，以及能够具有NhaA蛋白的过表达；所述NhaA蛋白为如下(a)或(b)的蛋白：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有NhaA蛋白活性的由(a)衍生的蛋白。

另一方面，本公开还提供了上述方法制备得到的工程菌。