[发明专利]编码NhaA蛋白的核酸的用途以及利用纤维素制备金合欢烯的方法

权利要求书

1.编码NhaA蛋白的核酸在制备产金合欢烯的工程菌中的用途，其中，所述NhaA蛋白为如下(a)或(b)的蛋白：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有NhaA蛋白活性的由(a)衍生的蛋白。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述编码NhaA蛋白的核酸为由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成的核酸；所述产金合欢烯的工程菌为能够利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯的工程菌。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述工程菌为大肠杆菌；所述能够利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯的工程菌中能够具有异戊烯焦磷酸异构酶、金合欢烯焦磷酸合成酶和金合欢烯合成酶的表达，并且能够具有组成甲羟戊酸途径的多种酶或者组成脱氧木酮糖-5-磷酸途径的多种酶的表达；

所述组成甲羟戊酸途径的多种酶包括乙酰乙酰基CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶；所述乙酰乙酰基CoA硫解酶为atoB酶和/或MvaE酶；所述HMG-CoA合酶为HMGS酶和/或MvaS酶，所述HMG-CoA还原酶为HMGR酶和/或MvaE酶；

所述组成脱氧木酮糖-5-磷酸途径的多种酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、2C-甲基-D-赤藓糖-2,4-环二磷酸合成酶、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶和异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。

4.一种制备产金合欢烯的工程菌的方法，其特征在于，该方法包括：通过对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入或染色体整合敲入的改造，使得改造后的工程菌宿主菌能够具有异戊烯焦磷酸异构酶、金合欢烯焦磷酸合成酶和金合欢烯合成酶的表达，并且能够具有组成甲羟戊酸途径的多种酶或者组成脱氧木酮糖-5-磷酸途径的多种酶的表达，以及能够具有NhaA蛋白的过表达；

所述NhaA蛋白为如下(a)或(b)的蛋白：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有NhaA蛋白活性的由(a)衍生的蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，通过对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入或染色体整合敲入的改造，使得改造后的工程菌宿主菌能够具有柠檬酸裂解酶和/或乙酸激酶的过表达。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述工程菌为大肠杆菌；所述组成甲羟戊酸途径的多种酶包括乙酰乙酰基CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶；所述乙酰乙酰基CoA硫解酶为atoB酶和/或MvaE酶；所述HMG-CoA合酶为HMGS酶和/或MvaS酶，所述HMG-CoA还原酶为HMGR酶和/或MvaE酶；

所述组成脱氧木酮糖-5-磷酸途径的多种酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、2C-甲基-D-赤藓糖-2,4-环二磷酸合成酶、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶和异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。

7.权利要求4-6中任意一项所述的方法制备得到的工程菌。

8.一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；

(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种权利要求7所述的工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。