[发明专利]重组广谱性绿僵菌及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种重组广谱性绿僵菌，其下调单胺氧化酶的表达或不表达，或者其体内色胺的含量高于野生型广谱性绿僵菌，所述重组广谱性绿僵菌为其菌株本身，其后代、其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或者它们之间的任意组合。在该重组广谱性绿僵菌中敲除单胺氧化酶基因，其能够显著提高广谱罗伯茨绿僵菌中色胺的浓度，进而显著提高杀虫效率，使野生型广谱绿僵菌的半致死时间LT50从7.33±0.445天缩短到6.136±0.488天；且对环境无害，生物安全性好，对人类无毒性。

技术领域

本发明涉及转基因菌株及其制备方法和用途，尤其涉及能够提高广谱性绿僵菌杀虫效率的重组广谱性绿僵菌及其制备方法和应用。

背景技术

昆虫病原真菌，相较于化学杀虫剂，具有环境友好、抗逆性强、能大量扩散、选择性高等优点，是广泛应用的一类生物农药。然而，目前昆虫病原真菌作为杀虫剂仍然存在着致死时间较长的缺点。通过研究真菌致病机理，利用基因工程手段改造真菌，提高真菌杀虫剂的效果是当前研究的一个重要方向。例如：

1、高表达真菌分泌的水解酶类基因。过表达体壁降解蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)Pr1A可以提高真菌穿透体壁的速度，显著提高了金龟子绿僵菌的毒力，加快致死速度并且在血腔中激活多酚氧化酶原系统，导致虫体迅速黑化，对烟草天蛾的致死时间减少了25％，害虫的取食率也降低了40％。Fang等将几丁质水解酶Bbchitl基因转入白僵菌基因组中，获得超表达工程菌株。该工程菌株对蚜虫的毒力明显增强。与野生菌株相比，工程菌株对蚜虫的致死剂量降低50％，致死时间缩短50％。

2、对真菌代谢基因的改造。Xia等通过构建真菌酸性海藻糖降解酶(ATM)超表达载体，转化广谱绿僵菌，增强真菌对寄主血淋巴中海藻糖的代谢能力，促进广谱绿僵菌在昆虫体内生长。

3、引入外源基因。北非蝎毒素(Androctonus australis neurotoxin)AaIT是鳞翅目、双翅目昆虫的特异性神经毒素。Wang等人将该基因导入绿僵菌后，能在寄主血腔中特异性表达神经毒素，改造后的真菌对烟草天蛾的毒性提高了22倍。

4、表达与免疫相关的基因。Yang等人在白僵菌中表达昆虫先天免疫识别通路Toll信号通路的丝氨酸抑制酶Spn43Ac，对桃蚜的半致死时间减少了24％，致死率提高了2倍。Fan等将葡萄糖-果糖氧化还原酶(Glucose-frustose oxidoreductase GFOR)基因导入白僵菌中，构建的转基因工程菌通过合成葡萄糖酸内酯(GDL)可以抑制寄主革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins GNBPs)的活性，抑制宿主的免疫反应，使真菌的致死时间减少了48h，杀虫效果得到提高。

但目前通过基因工程手段改造真菌仍然存在一些缺陷。例如，中国发明专利授权公告号为CN101755050公开的将优化的编码北非蝎(Androctonus australis)神经毒素AaIT的多核苷酸序列导入金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)中并表达，其可提高杀虫效率，有效用于昆虫的控制。但导入真菌中的蝎毒基因对人类有毒，会对人类造成一定危险。

绿僵菌属真菌被广泛用于害虫防治。目前超过200种农林害虫可被绿僵菌制剂控制危害。防治对象集中于直翅目的蝗虫类、蜚蠊目、同翅目的蚜虫、粉虱、叶蝉类以及鞘翅目的蛴螬等。绿僵菌属的代表种类有金龟子绿僵菌、罗伯茨绿僵菌和蝗绿僵菌等，不同种类的杀虫范围不同。如金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、罗伯茨绿僵菌(Metarhiziumrobertsii)为广谱性杀虫真菌。目前，野生型的广谱绿僵菌普遍存在着致死时间长，效果不理想，而通过基因工程手段改造的菌株对环境或人类存在着潜在的危险。

发明内容