[发明专利]靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法

说明书

本发明涉及靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术，针对wls基因，构建了能在相关细胞中表达shRNA的慢病毒真核表达载体，干扰慢病毒是由V#wls‑shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒(Helper 1.0、Helper 2.0)三质粒共转染293T细胞培养获得。本发明靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效、特异地抑制细胞wls基因表达，可为研究wls对相关细胞的分化及功能、相应组织的生长及发育等的调控作用提供一种有效的工具。发明还进一步公开了靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体在研究骨组织生长发育过程中wnt配体来源方面的应用，并为实现wnt信号通路在骨组织再生方面的应用提供了一定的理论基础。

技术领域

本发明涉及一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法与生物应用，属于生物技术领域。

背景技术

目前研究wnt通路中至关重要的wnt分泌蛋白的作用的研究主要集中在某种wnt蛋白或b-catenin分子上，然而目前发现哺乳动物中19种wnt配体蛋白的表达谱不尽相同，在其部位发挥的功能也不尽相同而又有所冗余代偿。Wnt通路可通过经典与非经典通路等发挥作用，对b-catenin的靶向敲除等技术并不能完全阻断wnt通路。然而靶向敲除wls基因的优势在于：1.敲除wls可以阻断几乎所有wnt蛋白的分泌，可避免众多wnt蛋白的功能代偿。2.利用wls敲除技术可以研究经典和非经典的wnt信号通路的总体作用。3.敲除wls技术可以研究wnt蛋白的自分泌和旁分泌作用。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法；并进一步公开其在研究骨组织wnt配体具体来源，及其对骨发育、骨矿化、骨代谢调控方面的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其包括如下步骤：

分别构建V#wls-shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0和病毒包装辅助质粒Helper 2.0；

将所述V#wls-shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0和病毒包装辅助质粒Helper 2.0共同对293T细胞进行转染，得到所述靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体。

作为优选方案，所述构建V#wls-shRNA重组载体质粒的构建方法是在V#shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段，元件顺序为U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-puromycin，酶切位点为克隆位点：Age I、EcoR I。

作为优选方案，所述的双链DNA片段为以下序列：

Wls-RNAi-V寡核苷酸序列：

正义链的序列如SEQ ID NO.1所示：

CCGGTCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGATTTTTG，

正义链的序列如SEQ ID NO.2所示：

GATCCAAAAATCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGA；