[发明专利]靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法

权利要求书

1.一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

分别构建V#wls-shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0和病毒包装辅助质粒Helper 2.0；

将所述V#wls-shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0和病毒包装辅助质粒Helper 2.0共同对293T细胞进行转染，得到所述靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体。

2.如权利要求1所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建V#wls-shRNA重组载体质粒的构建方法是在V#shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段，元件顺序为U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-puromycin，酶切位点为克隆位点：Age I、EcoR I。

3.如权利要求2所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的双链DNA片段为以下序列：

Wls-RNAi寡核苷酸序列：

正义链的序列如SEQ ID NO.1所示：

CCGGTCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGATTTTTG，

正义链的序列如SEQ ID NO.2所示：

GATCCAAAAATCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGA。

4.如权利要求1所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述病毒包装辅助质粒Helper 1.0的构建方法为：Helper 1.0载体质粒总长10703bp，含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。

5.如权利要求1所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述病毒包装辅助质粒Helper 2.0的构建方法为：Helper 2.0载体质粒总长6503bp，含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

6.如权利要求1所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述转染的操作方法为：接种细胞后，按照预实验合适的MOI值＝50进行目的病毒转染，8-12小时后换回普通培养液继续培养，48h后利用荧光显微镜拍照观察转染效率，72h后提取RNA与蛋白检测目的基因wls干扰效率。

7.一种如权利要求1所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体在研究骨组织生长发育过程中wnt配体来源方面的应用，其特征在于，包括如下步骤：靶向干扰骨细胞系MLO-y4中wls基因表达，干扰wnt配体的分泌，矿化诱导4天、7天后分别行碱性磷酸酶染色与茜素红染色检测其矿化能力。