[发明专利]用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括分别针对VKORC1‑1639、CYP2C9*2、CYP2C9*3等位基因及GAPDH内参基因的扩增引物；所述试剂盒包括包含所述扩增引物的PCR反应液。本发明提供的所述试剂盒灵敏度高，可达万分之一，最低检测限仅为1‑2拷贝，特别适合于低含量突变样本的检测；与测序法相比，本发明的检测结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；此外，还具有检测速度快，适用于高通量样本检测的优点。

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于检测华法 林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒。

背景技术

华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服 抗凝药物之一，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换 术及房颤导致的血栓形成。华法林治疗窗较窄，很小的剂量都可能导 致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低剂量者之 间可相差10倍以上。

维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)是维生素K循环 中的关键酶，华法林因抑制该酶而阻断维生素K以辅因子形式参与 羧化酶的催化反应，抑制了凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的功能活性，从 而产生抗凝作用。国内外大量研究发现：VKORC1基因突变会增加 该酶对华法林的敏感性，从而增强抗凝效果，其中比较常见的突变有 启动子区的G-1639A突变及1号内含子的C1173T突变。目前研究已 经证实1639G>A和1173C>T两个位点是完全连锁的。VKORC1 -1639AA(1173TT)基因型患者需要的华法林剂量显著低于1639GA 或GG(1173TC或CC)。美国食品药品监督管理局(FDA)明确指 出：在使用华法林时，建议检测VKORC1基因型。

华法林是由S-华法林和R-华法林组成的消旋体，在体内S-华法林 反映了60％～70％的抗凝活性，而R-华法林占30％～40％，其中S- 华法林主要由CYP2C9代谢，故CYP2C9基因多态性对华法林剂量 影响较大。CYP2C9具有高度遗传多态性，较常见的基因突变体是CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9*3(rs1057910)，其编码的酶活性分 别比野生型CYP2C9*1降低了30％和80％，导致CYP2C9基因突变 个体对华法林的需求剂量较低。携带这两个等位基因的个体服用华法 林后达到稳态浓度需要的时间较长，且在使用初期有较高出血危险性， 因此，CYP2C9*2或CYP2C9*3基因型个体服用华发林时应减少剂量， 但是等位基因突变个体长期治疗过程中过度抗凝的危险性没有增加。 其他突变体CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6以及CYP2C9*1l等 在人群中突变频率很低，其对华法林需求剂量的影响还有待于进一步 研究。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率在不同种族中有较大差 异。高加索人中，CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率大约分别是 8％～20％和6％～10％。而CYP2C9*2在亚洲人群中不存在，在美洲 黑人中大约是2％～4％。CYP2C9*3在亚洲人中的频率是l％～4％， 在美洲黑人中是l％～2％。临床研究结果显示，达到相同抗凝效果时， CYP2C9*2、*3基因型患者的使用剂量较野生型患者低。美国食品药 品监督管理局(FDA)明确指出：在使用华法林时，建议检测CYP2C9 基因型。

目前医院用于VKORC1和CYP2C9基因检测的“金标准”是PCR 直接测序法，但直接测序法的操作程序较复杂，敏感性不高，仅能检 测出20～30％以上的突变株等。相比于直接测序法，ARMS-TaqMan 法的灵敏性更高、成本更低。

ARMS也称作等位基因特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)， 其原理是PCR引物的3’端末位碱基与其模板DNA存在错配时，一 般将导致扩增效率急剧下降，设计等位基因特异性PCR扩增引物， 在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增信号，从而检测出突变。