[发明专利]一种用于检测登革病毒的荧光RT‑RAA引物、探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测血液样品中登革病毒(Dengue virus，DENV)的荧光RT-RAA引物、探针和检测方法。

背景技术

登革热(Dengue Fever)是由登革病毒(Dengue virus，DENV)引起,经伊蚊传播的一种急性传染病，是热带及亚热带地区儿童死亡的主要原因之一，其潜伏期通常约5-7天，具有传播迅猛、发病率高等特点。患者有可能出现极度疲倦及抑郁症状，少数病者会恶化至登革出血热，并进一步出血、休克，乃至死亡，登革热引起的并发症往往是病人致死的主因。登革热发病率最近几十年在全球大幅度上升。最近一项研究估计，每年约有3.9亿例登革热感染(95％置信区间2.84-5.28亿)，其中9600万(0.67-1.36亿)出现(不同严重程度的)临床症状。另一项有关登革热流行程度的研究表明，全世界有128个国家的39亿人面临登革热病毒感染风险。因此，为及时有效发现登革病毒，将该病毒防范于国门之外，建立快速、敏感、特异的DENV检测方法十分必要。

随着全球化发展，方便、快捷的交通运输工具使旅游及不同国家和地区动物、动物产品的跨境移动日益频繁，也给传染病的传播和流行创造了有利条件。此外，登革早期感染呈现不典型症状，与基孔肯雅病毒、寨卡病毒、乙脑病毒等其它虫媒病毒感染症状类似，很难区分，无疑进一步加大了登革病毒的防控难度。因此，建立快速诊断DENV感染的实验室方法显得尤为重要。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在病毒血症时期检测到病毒的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于DENV病毒的检测。目前，国内外已建立的DENV检测方法有实时RT-PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测登革病毒的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述具有相同功能具体包括能用于检测登革病毒的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测登革病毒的探针，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5'-CATTTTCTGGCGTTCTGTGCCTGGAATGATGNTGMNGAGACAGCAGGAT-3'，

其中，所述N代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述M代表具环状结构的化合物；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述N代表携带有荧光素基团FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸FAM-dT或携带有荧光淬灭基团BHQ的胸腺嘧啶脱氧核苷酸BHQ-dT，所述M代表四氢呋喃。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述具有相同功能具体包括能用于检测登革病毒的核苷酸序列。

具体的，所述探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测登革病毒的组合物，所述组合物包括下述1)和2)：