[发明专利]一种能有效提高蛋白分泌效率的信号肽及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种能有效提高蛋白分泌效率的信号肽及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，可内生抗逆孢子，细胞壁的组成结构简单，不含内毒素，仅有单层外膜，因此当分泌蛋白通过细胞膜，并在细胞间质进行加工折叠后，便直接释放进入培养液中。由于其对培养条件要求不高，且在规模化生产中能够保持较高的细菌浓度，因此其在工业酶的生产有着广泛应用。且其遗传学和生理学已得到深入研究，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌(Escherichia coli)。

基因工程中，信号肽对外源基因的表达水平有极大影响，是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其与成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前提蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白的折叠，对在蛋白分泌过程中起着重要作用。在枯草芽孢杆菌表达系统中，来源于革兰氏阳性菌的蛋白一般都能利用自身启动子和信号肽有效表达分泌，其表达产物对宿主菌的蛋白酶也有一定的耐受性，但是异源蛋白的分泌表达则较困难，通常都要与芽孢杆菌胞外蛋白动子和信号序列融合才能使分泌表达有效进行。因此，研究枯草芽孢杆菌自身不同种类的信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能有效提高蛋白分泌效率的信号肽。

本发明的另一目的在于提供所述能有效提高蛋白分泌效率的信号肽的编码基因。

本发明的又一目的在于提供所述能有效提高蛋白分泌效率的信号肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种能有效提高蛋白分泌效率的信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述能有效提高蛋白分泌效率的信号肽的基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；

(b)对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。

含上述任一所述能有效提高蛋白分泌效率的信号肽的基因的重组表达载体、重组基因工程菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述的重组基因工程菌为将上述任一所述能有效提高蛋白分泌效率的信号肽的基因融合到需要表达基因的N端，使融合后的基因编码的蛋白的N端融合有相应信号肽；优选为分泌β-半乳糖苷酶能力提高的基因工程菌，或为能分泌转谷氨酰胺酶的基因工程菌；更优选为枯草芽孢杆菌基因工程菌。

所述的能有效提高蛋白分泌效率的信号肽在提高目的蛋白分泌表达中的应用。

所述的目的蛋白为耐热β-半乳糖苷酶或转谷氨酰胺酶。

所述的目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达；优选为在枯草芽孢杆菌中分泌表达；更优选为在枯草芽孢杆菌ATCC6051(B.subtilis ATCC6051)中分泌表达。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，筛选出能提高β-半乳糖苷酶分泌的信号肽。同时构建该信号肽与转谷氨酰胺酶酶原编码基因相结合的表达载体，实现了转谷氨酰胺酶酶原的分泌表达。

2、本发明提供了一种氨基酸片段，具有很强的分泌表达活性的信号肽，能实现外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。

3、本发明通过融合信号肽，可以使β-半乳糖苷酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。

4、本发明通过融合信号肽，实现转谷氨酰胺酶酶原分泌表达。

附图说明

图1是实施例1中扩增biobrick的PCR产物电泳图；其中，泳道M：marker DNA；泳道1为biobrick的PCR扩增产物。

图2是实施例1中质粒pBEp43s-biobrick-bgaB和质粒pBEp43-SP-bgaB的构建示意图。

图3是实施例2中扩增SPyoqM片段电泳图；其中，泳道M为marker DNA；泳道1为SPyoqM片段。

图4是实施例2中表达质粒pBEp43-SPyoqM-proMTG的构建示意图。