[发明专利]一种外泌体微量DNA的建库方法

权利要求书

1.一种外泌体微量DNA的建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)TN5酶复合物制备：将包含转座子末端序列和标签序列的DNA序列与TN5酶包埋成TN5酶复合物；

(2)外泌体裂解及转座：将外泌体、所述TN5酶复合物和含有IGEPAL的反应缓冲液共同孵育，使所述外泌体裂解并使外泌体DNA片段化；

(3)片段纯化及扩增：对片段化的外泌体DNA进行纯化，然后对纯化的外泌体DNA进行扩增，得到外泌体DNA文库。

2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述方法还包括：

(4)文库环化及酶切：将扩增产物变性并环化以形成环化单链DNA，然后酶切去除未环化的DNA，得到外泌体DNA测序文库。

3.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述方法还包括：提取样本中的外泌体。

4.根据权利要求3所述的建库方法，其特征在于，通过梯度离心从样本中除去大的沉淀物，上清经微孔滤器过滤和超速离心得到微量外泌体。

5.根据权利要求4所述的建库方法，其特征在于，所述样本是体液或细胞培养液。

6.根据权利要求5所述的建库方法，其特征在于，所述体液包括血液、尿液、唾液、泪液、乳液、淋巴液。

7.根据权利要求4所述的建库方法，其特征在于，所述大的沉淀物包括细胞、细胞碎片和血小板。

8.根据权利要求4所述的建库方法，其特征在于，所述梯度离心是300-1500g离心。

9.根据权利要求4所述的建库方法，其特征在于，所述微孔滤器是孔径为0.22μm的滤器。

10.根据权利要求4所述的建库方法，其特征在于，所述超速离心是154,000g离心。

11.根据权利要求3所述的建库方法，其特征在于，所述提取样本中的外泌体的步骤中，还包括加入DNase I消化不需要的DNA。

12.据权利要求3所述的建库方法，其特征在于，外泌体DNA建库起始量小于1000pg。

13.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述标签序列是PCR扩增序列或测序接头序列。

14.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述DNA序列包括SEQ ID NO：1～3所示核苷酸序列构成的组中的单独的序列。

15.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述TN5酶复合物制备包括分别将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2退火，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3退火；然后将退火产物混合并加入TN5酶孵育形成所述TN5酶复合物。

16.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述IGEPAL在反应体系中的浓度是0.04～2(体积)％。

17.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述TN5酶复合物在反应体系中的体积占比是1.9～8.3(体积)％。

18.根据权利要求16所述的建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述IGEPAL在反应体系中的浓度是0.2(体积)％。