[发明专利]一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法

说明书

本发明公开了一种缺陷型腺病毒AdC68‑GP的培养方法，涉及病毒培养技术领域。其包括：将包装细胞接种至无血清培养基进行悬浮培养的细胞复苏步骤，以及根据细胞密度值即细胞密度1‑2×10⁶cells/ml和细胞成活率即等于或大于90％进行的传代接毒培养步骤，该培养方法通过使用无血清培养基对包装细胞进行悬浮培养，一方面有利于工艺放大，另一方面，接种缺陷型腺病毒AdC68‑GP时，降低MOI值，MOI控制在0.0001～0.01的范围即可提高病毒扩增倍数，增加病毒产量。

技术领域

本发明涉及病毒培养技术领域，具体而言，涉及一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法。

背景技术

缺陷型腺病毒AdC68-GP是以黑猩猩型腺病毒AdC68为基础经过改造后得到的能有效地诱导针对狂犬病毒的中和抗体，且对病毒感染可产生强大的抵抗力的腺病毒。

现有的培养缺陷型腺病毒AdC68-GP的方法存在的问题有工艺放大困难、培养过程中使用血清，不利于后期纯化，且血清质量不易控制，导致产品质量不易控制；接毒时MOI一般控制在0.1～10才能产生病变，接毒量大，且产毒不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法，该培养方法的接毒量小，得到的缺陷型腺病毒AdC68-GP质量高，易于用于工艺放大。

本发明是这样实现的：

一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法，其包括：

细胞复苏步骤：将包装细胞接种至无血清培养基进行悬浮培养，所述包装细胞含有缺陷型腺病毒AdC68-GP缺失的E1区；

传代接毒培养步骤：当培养至细胞密度大于1×10⁶cells/ml，且细胞活率等于或大于90％时，则进行传代培养，传代密度3～5× 10⁵cells/ml；在传代培养的同时，接种缺陷型腺病毒AdC68-GP，控制MOI为0.0001～0.01。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，控制MOI为 0.0001～0.0095。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，控制MOI为 0.0001～0.008。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，控制MOI为 0.0008～0.004。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，控制MOI为 0.0014～0.0028。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在传代培养步骤中，传代培养的培养条件为：温度36-38℃、7-9％CO₂、转速110-150rpm。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在传代培养步骤中，离心处理的条件为转速800-1200rpm、时间4-8min。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在细胞复苏步骤中，悬浮培养的培养条件为：温度36-38℃、7-9％CO₂、转速110-150rpm。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在细胞复苏步骤中，所述包装细胞为人胚肾293悬浮细胞。

生产腺病毒的包装细胞主要为人胚肾293细胞(HEK293)，它包含有腺病毒缺失的E1区，用于E1区缺失腺病毒生产的包装细胞， HEK293细胞属于贴壁细胞系，贴壁培养最普遍的方式是培养瓶和T 形瓶等，其结构和操作简单，投入少，但单位体积能提供细胞生长的表面积小，不能满足大规模生产。