[发明专利]一种腺病毒的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，具体而言，涉及一种腺病毒的纯化方法。

背景技术

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的双链DNA病毒，直径为70～90nm，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，衣壳里是线状双链DNA分子，腺病毒分两个属，共约100余血清型。一般会造成呼吸系统的不适，对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞，但对人体不出现致癌性。

腺病毒作为载体应用于疫苗的开发具有以下优点：感染的宿主范围广，能感染分裂和非分裂细胞，导入细胞的效率高；遗传背景清楚，致病性低，不整合到染色体中不会导致插入突变；外源基因表达水平高，可以容纳约8-10kb的外源基因，能同时表达多个基因；增殖速度快，易培养，可以产生较高的病毒滴度，适用多种途径免疫。基于上述优点，腺病毒是一种大有潜力值得试验和推广的疫苗载体，在新型疫苗研究中越来越显示出良好的应用前景。故对腺病毒的纯化显得尤为重要。

采用凝胶过滤层析、离子交换层析及二者结合的方法对腺病毒进行纯化。凝胶过滤耗时长，受上样体积限制。采用离子交换层析可进行大体积上样，但经离子交换不能对缺陷型及完整病毒进行分离，病毒收率较低。还有采用凝胶过滤层析、离子交换结合的方法，过程步骤繁琐，不易于开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种腺病毒的纯化方法，该纯化方法可以获得具有完整病毒颗粒的腺病毒，病毒回收率高。

本发明是这样实现的：

一种腺病毒的纯化方法，其包括：

预处理步骤：

对收集的腺病毒细胞培养液第一次离心，收集细胞沉淀，用缓冲液冲重悬所述细胞沉淀，得到重悬液，冻融处理破碎所述重悬液中的细胞，将所述重悬液进行第二次离心，收集上清液；

密度梯度离心步骤：

将所述上清液加入至密度梯度介质溶液中，进行密度梯度离心，吸取完整病毒颗粒带溶液；

浓缩换液步骤：

将所述完整病毒颗粒带溶液进行浓缩、换液以及过滤，得到含有腺病毒的溶液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述密度梯度介质溶液中的密度梯度介质为氯化铯、甘油或蔗糖。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述密度梯度介质溶液中的密度梯度介质为氯化铯，所述密度梯度介质溶液的密度梯度为1.2-1.4g/mL。

选择合适的密度梯度可以有效地将非完整病毒颗粒和完整病毒颗粒大部分地分离。在以氯化铯作为密度梯度介质的前提下，以1.2-1.4g/mL范围的密度梯度可以实现大部分地分离非完整腺病毒颗粒和完整腺病毒颗粒，提高病毒回收率。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，密度梯度离心的转速为15000-22000g，时间为1.5-2.5h。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，密度梯度离心的转速可以是15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g、21000g、22000g等中的任意一者或任意两者之间的范围(例如15000-16000g、16000-17000g、17000-18000g、18000-19000g、19000-20000g、20000-21000g等)；

密度梯度离心的时间可以是1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2.0h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h、2.5h等中的任意一者或任意两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一次离心的转速为1800-2200rpm，时间为5-10min。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，第一次离心的转速可以是1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm等中的任意一者或任意两者之间的范围(例如1800-1900rpm、1900-2000rpm、2000-2100rpm、2100-2200rpm等)；

第一次离心的时间可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等中的任意一者或任意两者的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第二次离心的转速为8000-12000rpm，时间为5-10min。