[发明专利]聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法

权利要求书

1.一种聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的制作方法包括下列步骤：

S1、取ICR小鼠全皮制成一定直径的圆形脱细胞真皮基质支架；

S2、氧化石墨烯在碱性条件下超声制得羧基化氧化石墨烯，在EDC催化下，将聚乙二醇接枝到羧基化氧化石墨烯上制成聚乙二醇修饰的氧化石墨烯；

S3、再通过磁力搅拌将槲皮素吸附到聚乙二醇修饰的氧化石墨烯上；

S4、将制成的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯载槲皮素复合物交联到脱细胞真皮基质支架表面；

S5、制作得到基于聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D复合支架。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的脱细胞真皮基质支架的制作过程如下：

选取12周龄的雄性ICR小鼠，以颈椎脱臼法处死，经脱毛，取小鼠背部皮肤，将取得的小鼠背部皮肤用PBS溶液浸泡清洗3遍，然后浸泡在0.25％的中性蛋白酶水溶液中，于4℃下保存48h且24h换一次液，以去除皮肤表皮组织，将去除表皮后的小鼠皮肤组织用PBS溶液冲洗3遍，再浸泡在0.3％的Triton X-100与0.02％的EDTA的混合溶液中，于室温下摇床处理48h且每24h换液一次，以去除皮肤组织中的细胞成分；

将脱表皮和脱细胞后的皮肤真皮组织分别浸泡于50％、75％和100％浓度的乙醇溶液中30分钟进行梯度脱水，脱水后的皮肤真皮组织浸泡于氯仿中约20分钟静置至透明，以去除组织中的脂肪成分，用无水乙醇多次清洗组织至无气味，将无水乙醇清洗过的组织分别浸于75％乙醇、50％乙醇和双蒸水中30分钟还水，制得脱细胞真皮基质，然后用直径为7mm的圆形生物打孔器将脱细胞真皮基质裁剪成多个脱细胞真皮基质支架，并用PBS溶液冲洗3遍，然后浸泡在70％的乙醇中于4℃下浸泡1星期除菌；

将已除去细菌的脱细胞真皮基质支架转移至超净台，用无菌的PBS溶液冲洗5遍，然后浸泡在无菌的PBS溶液中，于4℃下封口保存。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3D药物复合支架的制作方法，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的制作过程如下：

称取单层片状的氧化石墨烯30mg置于50mL离心管，加入30mL超纯水，用超声波细胞粉碎机超声分散1h，称取3.6g NaOH和3g氯乙酸固体加入到超声后的氧化石墨烯分散液中继续超声分散1h，得到浓度为1mg/mL的羧基化氧化石墨烯分散液，室温静置3h；

用100kDa离心超滤管离心，10000转，40分钟，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至羧基化氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.5mg/mL备用；

避光称取2mg EDC加入到5mL浓度为0.5mg/mL的羧基化氧化石墨烯分散液中，在超声波清洗仪中超声20分钟，然后滴加三乙胺调节PH值至弱碱性，即PH≈8.0，称取30mg聚乙二醇加入到活化羧基后的羧基化氧化石墨烯分散液中磁力搅拌过夜，用100kDa离心超滤管离心，14000r，1h，收集沉淀加超纯水重悬，过滤清洗5次以上，至聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散液PH呈中性，用超纯水稀释至0.1mg/mL，4℃下封口保存；

采用紫外吸收分光光度计测浓度为0.1mg/mL的样品紫外吸收峰值，测定样品的Zeta电位和水合粒径采用Zeta电位仪在25℃，水分散液注入样品池，zeta电位和水合粒径值是至少三次连续测量的平均值，并将制得的样品用傅里叶变换红外光谱仪检测样品基团的红外光谱吸收值，拉曼光谱信号的采集则选用激光共焦显微拉曼光谱系统。