[发明专利]一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用

说明书

本发明属于全程热启动Taq酶制备技术领域，公开了一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、用途。该配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对温度≤96℃条件热稳定，在温度≤96℃时，其封闭或开放Taq酶活是可逆的，可在整个PCR循环中全程参与Taq酶的热启动，实现每个循环过程都是在引物与模板处于严谨配对时Taq酶热启动，避免非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，使得DNA聚合酶链式反应结果杂带少、噪音低，保真性更完善，同时又由于上述配体为短肽结构，与抗体相比较，分子量更小，对PCR干扰小，且不像单链DNA那样容易降解，用其制备的全程热启动Taq酶产品稳定性更好。

技术领域

本发明属于热启动Taq酶制备技术领域，具体涉及一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用。

背景技术

热启动Taq酶又称热启动耐高温DNA聚合酶，已越来越多地被用于PCR技术中，特别是多位点基因复合扩增技术中，如在动植物的微卫星基因、人的个体识别或亲子鉴定分析中。这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是：热启动Taq酶的酶活是在反应体系由高温(95℃)降至退火温度的过程中释放恢复的，即在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR扩增的，所以这种扩增是一种较严谨真实的扩增，杂带少、本底少、噪音低、效率高。

目前，制备热启动Taq酶的方法包括以下几种：石蜡包被法、抗体介导抑制法、化学修饰法、ssDNA链(适配子)结合法和肝素盐法。然而，通过这些方法制备的热启动Taq酶都是PCR开始循环阶段的“一次性热启动”，在石蜡包被法的制备过程中酶易被污染，抗体介导抑制法和肝素盐法因抗体和肝素盐分子量很大会影响PCR扩增过程，ssDNA链(适配子)结合法中单链DNA对热不稳定，因此上述方法制备的热启动Taq酶经过一个PCR循环就被降解贻尽，不稳定，无法全程热启动。再如中国专利文献CN101050453B公开的一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，其通过特定的化学修饰法来可逆地封闭DNA聚合酶的活性，同时该酶在弱碱性条件下(pH＝8-9)经高温(94℃以上)处理一定时间，DNA聚合酶的活性经过解封闭逆转而得到恢复。经过该方法修饰的耐高温DNA聚合酶在DNA聚合酶链式反应过程中，极大地降低了DNA聚合酶在低温时的3’到5’端延伸的酶活性，从而极大地提高了该DNA聚合酶的反应特异性、可靠性、均一性和灵敏度，然而上述的热启动耐高温DNA聚合酶第一个循环为热启动酶，而后续循环就是普通Taq酶，也属于“一次性热启动”，因此使用上述的热启动耐高温DNA聚合酶进行DNA聚合酶链式反应还会存在一定的杂带和噪音，保真性不完善。

鉴于此，如何对现有的热启动Taq酶的制备方法进行改进以获得一种全程热启动Taq酶，这对于本领域的技术人员来说仍然是一个尚未解决的技术难题。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有的热启动耐高温DNA聚合酶进行DNA聚合酶链式反应存在杂带、噪音及保真性不完善的问题，从而提供一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体，所述配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种制备上述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体的方法，包括如下步骤：

(1)从噬菌体表面展示肽库中淘选出温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的阳性噬菌体；

(2)扩增步骤(1)中的阳性噬菌体，经消化酶消化后进行过滤，获得含有温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的配体的滤液，加热所述滤液至93-99℃保持110-130min，然后将所述滤液与所述Taq酶混合，从中筛选出在温度≤65℃条件下无Taq酶活性且温度65℃条件下有Taq酶活性的滤液及其对应的阳性噬菌体；