[发明专利]血清miRNAs生物标志物及其应用

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及血清miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用，其筛选方法包括以下步骤：1)从血清中提取包括miRNAs在内的总RNA；2)比较慢乙肝和慢乙肝后肝硬化患者的miRNAs表达谱，找出肝硬化患者血清中异常表达的miRNAs；3)用实时定量RT‑PCR方法，经小样本初筛及扩大样本验证，筛选可用作肝硬化标志物的miRNAs；4)ROC曲线进行相关分析。本发明筛选的慢乙肝后肝硬化辅助诊断标志物为miR‑27a，在肝硬化患者血清中呈高表达，并影响肝星状细胞的增殖，具有潜在诊断和治疗价值，且样本易得、收集简便、无创，具有重要的学术意义和广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及血清miRNAs生物标志物的筛选方法及其在慢乙肝后肝硬化诊断标志物发现中的应用。

背景技术

我国是肝病大国，仅慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者就有2000万人之多，其中有20％以上患者逐步发展为肝硬化，为我国的重大疾病之一。长期以来，我国一直把慢性肝病的防治列为国家科技攻关计划。

MicroRNAs(miRNAs)是现代生物医学中的一个重要的调节分子，它通过对基因转录表达的调控，调控着人体所有细胞、组织和器官的各种功能，在人类疾病的发生和防治中具有十分重要的作用。大量研究发现，miRNAs可以广泛而稳定地存在于细胞外液，包括血清、血浆和组织间液之中。它们不仅是细胞内基因转录和表达的调节分子，还是细胞之间信息传递的信号分子。在病理过程中，血清/血浆miRNAs表达谱会发生特征性的改变，这些改变有助于对疾病进行诊断和预后判断，甚至与临床分期分级密切相关。且循环(血清/血浆)中miRNAs作为疾病诊断和预后的标志物，具有检测损伤小、稳定性好、灵敏度高等诸多优点。

在正常机能状态下，机体内循环miRNAs种类及其表达丰度可能处于一个相对稳定、平衡的状态。肝脏作为机体物质能量代谢枢纽，慢性肝病常常伴随着不同程度、反复性的组织损伤－修复过程，可能会直接或间接破坏机体循环miRNAs稳态，表现为异常代谢或特定疾病状态下某些循环miRNAs的表达水平显著性升高或降低。

本发明采用微阵列芯片和实时定量PCR方法进行检测，发现在慢乙肝后肝硬化患者血清中呈高表达、并与肝硬化严重程度相关的miRNAs，再通过体外实验证实活化后的肝星状细胞及其培养基中此类miRNAs呈高表达；miR-27a影响肝星状细胞的增殖，提示miR-27a对肝硬化的诊断和治疗有重要潜在价值和应用前景。

发明内容

本发明旨在提供一种血清miRNAs生物标志物的筛选方法。

本发明还将筛选出的生物标志物血清miRNAs用于慢乙肝后肝硬化的诊断标志物或辅助诊断标志物。

技术方案为，血清miRNAs生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：

1)采集健康者、慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者的血清，提取总RNA；

2)初筛：检测慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者临床血清标本中miRNAs表达，比较慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者的miRNAs表达谱，筛选肝硬化患者血清中异常表达的miRNAs作为候选；

3)复筛：采用实时定量RT-PCR技术，测定血清中候选miRNAs的含量，进行小样本和/或扩大样本筛选，筛选和确定用作肝硬化标志物的miRNAs；

4)评价：采用ROC曲线法对步骤3)筛选的肝硬化标志物miRNAs进行临床价值评价。

上述血清miRNAs生物标志物的筛选方法，还包括采用MTS法对步骤3)筛选的肝硬化标志物miRNAs进行肝星状细胞增殖的抑制价值评价。具体为用MTS法检测肝硬化标志物miRNAs对肝星状细胞，尤其是LX2人肝星状细胞增殖的影响。

还可以包括：用TGFβ1干预LX2肝星状细胞，并检测细胞内和培养基中肝硬化标志物miRNAs的表达。