[发明专利]同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用，属于食源性致病菌检测技术领域。本发明由固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片、特异性引物和通用引物组成。本发明可以一次反应同时对结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌等19种食品典型致病菌进行快速、灵敏的检测。提供传统方法无法提供的多重扩增、多重检测相结合的检测数据，该检测方法从样品处理到检测结果仅需1‑2小时左右，准确率为100%，操作步骤简单，检测时间短，特异性强，灵敏度高，重复性好；可对引起食源性疾病的19种病原体进行准确的分型检测，用作食源性致病菌的快速筛查。

技术领域

本发明涉及食源性病菌检测技术领域，特别涉及一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用。

背景技术

由食源性致病菌引起的食源性疾病已成为当今世界上最关注的公共卫生问题之一。WHO将大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌依次列为四种重要的食源性致病菌，并且列为中国进出口产品的必检项目。在我国，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌为食物中最常见病原菌。据我国2013年卫生部的全国食物中毒事件情况通报显示，微生物性食物中毒人数最多，占食物中毒事件总中毒人数的60.4％，主要是由沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌等引起的细菌性食物中毒。这些致病菌的存在严重威胁着人类健康，快速检测食品中的致病菌是保障食品质量安全，预防食源性疾病暴发的有效手段。

目前对于食源性病原菌的检测大多仍沿用细菌培养及生化鉴定方法，检验步骤繁琐复杂，检测周期较长，而且无法对难以培养的病原菌进行检测；而一些简单的分子生物学和免疫学方法存在着假阳性率较高以及一次只能检测一种或几种致病菌等缺点和不足，不能满足食品安全快速检测需求，也不利于食物中毒等突发事件处理。因此需要建立一种简便、快速、准确的食源性致病菌筛查和检验技术，以满足日常检测的需求。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，解决现有技术中食源性病原菌检测步骤繁琐。检测周期长、无法检测难以培养的病菌、一次性检测种类少的问题，本发明提供了一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其制作方法和应用。

本发明的技术方案为：

一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒，由固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片、特异性引物和通用引物组成；其中所述19种致病菌为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157、肠集聚性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、产志贺毒素大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型；所述特异性引物为能对所述19种致病菌靶基因进行特异性扩增的引物；所述通用引物为与所述19种致病菌靶基因无关的核酸序列；其中所述通用引物中的反向通用引物5’端带有荧光标记。

作为优选方案，所述食源性致病菌并行检测基因芯片中19种致病菌特异性探针为：

结肠弯曲菌：5’—ACC TTT GAC GGC ATT ATC TC—3’；

空肠弯曲菌：5’—ATC CAT CTT CTA TCA TTG CC—3’；

阪崎肠杆菌：5’—AAC TGG GAC CAA CCC AGT TT—3’；

大肠杆菌O157：5’—ACG GGT CAA CGT TAG AAC AT—3’；

肠集聚性大肠杆菌：5’—ATT CCG TAT ATT ATC ATC AG—3’；

肠出血性大肠杆菌：5’—AAC TGC TCT GGA TGC ATC TC—3’；