[发明专利]一种NK细胞体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及人类细胞培养技术领域，具体为一种NK细胞体外培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，是机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。在杀伤靶细胞的过程中，NK细胞可以非特异性识别靶细胞，并且不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的限制，对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。但是正常人体外周血中的NK细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的10％～20％。因此，获得高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用最为关键的问题之一。目前，随着生物治疗临床应用的广泛开展，NK细胞治疗取得了一定的临床疗效。

目前，体外培养的NK细胞具有排异性，不能对任何病人使用，在对病人进行治疗时，具有一定的安全风险，对病人的生命安全造成影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种NK细胞体外培养方法，通过取用病人本体外周血液中的细胞，有效防止细胞排异性的发生，提高治疗过程的安全性，通过在体外大量培养NK细胞，便于对病人进行治疗。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种NK细胞体外培养方法，包括NK细胞提取和NK细胞培养的方法，所述NK细胞提取和NK细胞培养的方法包括下述步骤：

1)抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血；

2)向绿盖管的血液中加入悬浮液，轻轻摇动混合均匀，向离心管里加入细胞分离液，将离心管放入离心机进行离心操作，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的离心管中；

3)向取出的白膜层中加入细胞洗液，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心结束，弃上清，再次向白膜层中加入细胞洗液，放入离心机离心内，完成操作；

4)向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，将处理过的血清加入培养瓶中，将培养瓶置培养箱内培养；

5)约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用。

优选的，所述培养基内设有修正液和白介素，所述培养基内的比例为每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素-2。

优选的，所述培养瓶使用PBS进行清洗。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过取用病人本体外周血液中的细胞，有效防止细胞排异性的发生，提高治疗过程的安全性，通过在体外大量培养NK细胞，便于对病人进行治疗。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明提供一种技术方案：一种NK细胞体外培养方法，包括NK细胞提取和NK细胞培养的方法，所述NK细胞提取和NK细胞培养的方法包括下述步骤：

1)抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血；

2)向绿盖管的血液中加入悬浮液，轻轻摇动混合均匀，向离心管里加入细胞分离液，将离心管放入离心机进行离心操作，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的离心管中；

3)向取出的白膜层中加入细胞洗液，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心结束，弃上清，再次向白膜层中加入细胞洗液，放入离心机离心内，完成操作；

4)向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，将处理过的血清加入培养瓶中，将培养瓶置培养箱内培养；

5)约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用。

所述培养基内设有修正液和白介素-2，所述培养基内的比例为每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素，通过在培养基内添加修正液和白介素-2，便于配置合适NK细胞生长的培养基。

所述培养瓶使用PBS进行清洗，通过使用PBS对培养瓶进行清洗，便于对培养瓶进行清洁。